1. Mesure du déclin de la protéostasie dans le tissu musculaire en utilisant des animaux exprimant de la polyglutamine
REMARQUE : Deux méthodes peuvent être utilisées pour identifier le déclin de la protéostasie dans les cellules musculaires : l’imagerie de la formation d’agrégats de protéines au cours du vieillissement (1.1) et la mesure de la protéotoxicité que ces agrégats provoquent avec l’âge jusqu’à l’apparition de la paralysie (1.2).
- Imagerie de la formation d’agrégats de polyglutamine dans le muscle au cours du vieillissement
note: La progression de l’agrégation des protéines dans les cellules musculaires en fonction de l’âge est imagée à l’aide de répétitions de polyglutamine (polyQ) fusionnées à une protéine fluorescente jaune (YFP). Ce protocole décrit l’utilisation de la souche AM140 rmIs132[unc-54p ::Q35 ::YFP], mais d’autres souches variantes de polyglutamine peuvent également être utilisées. Le transgène polyQ ::YFP est exprimé dans le muscle à l’aide du promoteur musculaire spécifique du muscle unc-54. Des animaux exprimant unc-54p ::p olyQ ::YFP synchronisés sont visualisés aux jours 1, 2, 3 et 4 de l’âge adulte. Pour visualiser les agrégats unc-54p ::p olyQ ::YFP, utilisez un microscope composé équipé pour la fluorescence ou un microscope de dissection fluorescent. AM140 est disponible au Caenorhabditis Genetics Center (CGC) à l’adresse suivante : https://cgc.umn.edu/strain/AM140
- Les jours d’imagerie (jours 1, 2, 3 et 4 de l’âge adulte), prélever 20 animaux et les monter sur une lame de microscope avec un tampon d’agarose à 3 % et une goutte de 5 μL d’azoture de sodium 10 mM (dilué dans un tampon M9).
- Une fois que tous les animaux ont été immobilisés par l’azoture de sodium (~ 5 minutes), imagez l’ensemble du corps des animaux à l’aide d’un objectif de grossissement 10x (Figure 1A). Pour l’imagerie, utilisez un filtre FITC et la même exposition pour chaque animal. Supprimer les lames après l’imagerie.
note: Alternativement, les foyers YFP peuvent également être quantifiés directement sur les plaques, mais le mouvement doit être inhibé en appliquant un flux de dioxyde de carbone sur la plaque pendant le pointage. Cette méthode alternative est la plus appropriée lors du dépistage d’un grand nombre de conditions.
- Après l’acquisition des images, comptez le nombre de foyers dans les muscles de la paroi corporelle de l’animal entier. Les foyers sont des signaux ponctués plus brillants qui peuvent être différenciés du signal soluble plus faible en arrière-plan.
- Tracez la progression de l’accumulation des foyers YFP à partir des jours 1, 2, 3 et 4. Tracez un graphique XY où X représente le nombre de jours de l’âge adulte et Y représente le nombre de foyers unc-54p ::p olyQ ::YFP (Figure 1B). Le nombre de foyers dans les conditions expérimentales (p. ex., régulation négative ou surexpression des gènes) est comparé à celui des animaux témoins. Effectuez une analyse statistique entre les groupes à chaque point temporel observé pour chaque essai.
- Lorsque vous comparez le nombre de foyers pour seulement deux conditions, effectuez un test t d’échantillon indépendant à chaque point temporel.
- Lorsque vous comparez le nombre de foyers pour plus de deux affections, effectuez une analyse ANOVA unidirectionnelle omnibus pour chaque point temporel, y compris les données relatives à toutes les affections à ce point temporel. Si l’ANOVA omnibus donne une valeur p significative (c’est-à-dire p < 0,005), effectuez une analyse post-hoc avec des tests t d’échantillon indépendants par paires pour déterminer les conditions spécifiques entre lesquelles une différence significative de foyers a été détectée (par exemple, pour les groupes A, B et C, comparez A et B, A et C, et B et C).
2. Mesure des taux de paralysie animale comme substitut de la toxicité de la polyglutamine dans les cellules musculaires
REMARQUE : L’augmentation des agrégats polyQ dans le muscle en fonction de l’âge provoque le déclin de la fonction musculaire qui entraîne la locomotion. Ce défaut de locomotion peut être déterminé en mesurant le taux progressif de paralysie chez les animaux exprimant polyQ. Pour le test de paralysie, les animaux exprimant unc-54p ::p olyQ ::YFP synchronisés sont notés aux jours 3, 5, 7 et 9 de l’âge adulte. Ajoutez des points temporels supplémentaires au besoin, afin d’élargir la plage de pointage de sorte que l’effet de la perturbation génétique puisse être évalué.
- Les jours de pointage (jours 3, 5, 7 et 9 de l’âge adulte), regardez les plaques de 6 cm contenant 50 animaux et notez le nombre d’animaux paralysés. Retirez les animaux paralysés de l’assiette. Si des animaux ont rampé hors de l’assiette ou sont morts, ils devraient être censurés ; Enregistrez l’événement afin qu’il puisse être pris en compte dans l’analyse.
note: Un animal est considéré comme paralysé lorsqu’aucun mouvement n’est observé après l’avoir exposé à des stimuli tactiles légers ou doux. L’activité de pompage pharyngé est utilisée pour déterminer si les animaux immobiles sont vivants ou morts.
- À la fin de l’expérience, calculez le taux de paralysie pour chaque condition. Faites-le à chaque point temporel en divisant la fraction d’animaux paralysés par le nombre total d’animaux observés pour cette condition. Si vous observez plusieurs plaques par condition et par point temporel (c’est-à-dire des plaques répétées), calculez le rapport séparément pour chaque répétition.
- Tracez la progression du taux de paralysie dans un graphique XY (nuage de points). X représente le nombre de jours de l’âge adulte et Y représente les taux de paralysie. Le taux de paralysie des animaux unc-54p ::p olyQ ::YFP est comparé à celui des animaux témoins (Figure 1C). Effectuer des analyses statistiques entre les groupes ; Pour plusieurs essais, traitez les essais indépendamment. Utilisez la régression à risques proportionnels de Cox et le test de Wald. La plupart des outils d’analyse de données qui prennent en charge l’analyse de survie prennent également en charge la modélisation de Cox.
- Transformez les données : chaque condition doit avoir deux colonnes, une pour le temps et une autre pour « l’événement ». À chaque point temporel observé, ajoutez une ligne avec « 0 » pour chaque animal paralysé et un « 1 » pour chaque animal censuré. Le nombre total de rangées doit être égal au nombre d’animaux de départ sur la plaque pour cette condition.
- Effectuez la modélisation des risques proportionnels de Cox, suivie du test de Wald, selon les instructions du logiciel statistique. Un modèle univarié conviendra aux plans d’expérience typiques. Pour plus de deux conditions, si un test incluant toutes les conditions indique un résultat significatif (c’est-à-dire p < 0,005), des tests par paires entre les conditions peuvent être effectués pour déterminer la ou les paires significatives spécifiques de conditions.
note: Le modèle de Cox repose sur l’hypothèse que la ou les conditions de test modulent proportionnellement la probabilité d’un événement au fil du temps. Cela signifie, par exemple, que le modèle de Cox ne serait pas approprié pour comparer une condition dans laquelle la plupart des animaux sont paralysés au jour 1 à une condition dans laquelle la plupart des animaux sont paralysés au jour 9. Des extensions du modèle de Cox et d’autres approches permettant de comparer les proportions de personnes paralysées à chaque point temporel sont disponibles pour les cas où l’hypothèse des risques proportionnels ne tient pas.
