Essai de co-incubation bactérienne : une technique basée sur la microscopie à fluorescence pour visualiser la compétition bactérienne intraspécifique au niveau de la cellule unique

Résumé

Source : Smith, S., et al., Quantification de la compétition interbactérienne à l’aide de l’imagerie par fluorescence unicellulaire. J. Vis. Exp. (2021).

Cette vidéo présente une méthode basée sur la microscopie à fluorescence pour étudier la compétition bactérienne au niveau de la cellule unique. Cette méthode permet de mieux comprendre la structure et la fonction des communautés bactériennes.

Protocole

1. Co-incuber des souches bactériennes

1. Choisissez deux souches bactériennes pour des essais de compétition bactérienne unicellulaire. Ici, deux souches de V. fischeri sont utilisées : une souche cible (ES11424) et une souche inhibitrice (MJ1125) qui est connue pour tuer la souche cible en utilisant le système de sécrétion de type VI sur le chromosome II (T6SS2)1, qui est un mécanisme de destruction dépendant du contact.
2. Transformez des souches avec des plasmides stables codant pour des gènes pour différentes protéines fluorescentes (par exemple, GFP ou RFP) pour distinguer visuellement les types de souches au microscope. Ici, la souche inhibitrice est marquée avec un plasmide codant pour la GFP (pVSV102), et la souche cible est marquée avec un plasmide codant pour dsRed (pVSV208).
3. Commencer par des cultures mi-log pour les deux souches, mesurer et enregistrer la densité optique à 600 nm (OD₆₀₀) pour tous les échantillons.
4. Normaliser chaque échantillon à une DO_{de 600} = 1,0, ce qui correspond à environ^10,9 UFC/mL pour V. fischeri, en diluant la culture avec un milieu LBS.
5. Mélangez les deux souches concurrentes selon un rapport de 1:1 en fonction du volume en ajoutant 30 μL de chaque souche normalisée dans un tube de 1,5 mL marqué. Vortex, la culture mixte pour 1-2 s.
   note: Dans certains cas, il peut être approprié de mélanger des cocultures dans des proportions différentes. Par exemple, lorsqu’une souche pousse beaucoup plus vite qu’une autre, il peut être nécessaire de commencer la souche à croissance lente avec un avantage numérique afin d’observer la concurrence. Une optimisation peut également être nécessaire si la DO₆₀₀ ne correspond pas à des UFC/mL similaires pour les deux souches.
6. Répétez l’étape 1.5 pour chaque répétition biologique et chaque traitement. Dans l’exemple présenté ici, cela se traduira par un total de quatre tubes de souche mixte : deux répétitions biologiques avec la souche inhibitrice de type sauvage mélangée à la souche cible et deux réplicats biologiques avec la souche mutante du système de sécrétion de type VI mélangée à la souche cible.
7. Pour s’assurer que les cellules concurrentes sont suffisamment denses pour une destruction dépendante du contact dans la coïncubation sur la plaque gélosée, concentrez chaque culture mixte 3 fois en centrifugeant la culture mixte dans un tube à centrifuger standard de 1,5 mL pendant 1 min à 21 130 x g, en jetant le surnageant et en remettant chaque pastille en suspension dans un milieu de 20 μL LBS. Répétez l’opération pour chaque sample.
   note: Certaines cellules bactériennes sont sensibles aux dommages causés par la centrifugation à un rcf élevé ; Dans ce cas, la culture mixte peut être centrifugée pendant 3 min à 4600 x g. De plus, lors de la quantification de la compétition dépendante du contact, il est important d’assurer une densité cellulaire suffisante sur la lame pour observer la destruction. Dans cet article, les traitements « surpeuplés », où la destruction est observée, avaient environ 10 cellules/20 μm².

2. Configuration de la diapositive

1. Lorsque vous utilisez un microscope vertical, placez un tampon d’agarose² de ~5 mm sur une lame de verre standard de 1 mm. Placez 2 μL d’une culture mixte sur le tampon d’agarose et placez une lamelle de recouvrement #1.5 (25 mm²) sur la tache. Voir la figure 1B.
2. À l’aide d’un microscope inversé, repérer 2 μL d’une culture mixte sur le fond de lamelle #1.5 d’une boîte de Pétri de 35 mm et placer un tampon d’agarose^{de ~}5 mm 2 sur le point de coïncubation. Placez une lamelle en verre circulaire de 12 mm sur le tampon d’agarose. Voir la figure 1C pour un exemple.
3. Répétez les étapes 2.1 ou 2.2, selon la configuration du microscope utilisé, pour les trois cultures mixtes restantes, ce qui donne quatre lames ou boîtes à imager.
4. Laissez les diapositives reposer sur la paillasse pendant environ 5 minutes avant de continuer. Cela permet aux cellules de se déposer sur la gélose et d’éliminer tout mouvement pendant le processus d’imagerie.

3. Microscopie à fluorescence

1. Commencez par vous concentrer sur les cellules à l’aide de la lumière blanche (contraste de phase ou CIV) pour minimiser les effets du photo-blanchiment. Sur la base de la taille moyenne d’une seule cellule bactérienne, utilisez un objectif à huile 60x ou 100x.
2. Ajustez le temps d’exposition et les paramètres d’acquisition pour chaque canal afin que les cellules soient visibles dans le canal approprié avec une détection d’arrière-plan minimale.
   note: Il convient d’utiliser des durées d’exposition différentes pour différents canaux, mais le même temps d’exposition doit être utilisé pour toutes les répétitions biologiques et tous les traitements d’un canal donné.
3. Pour chaque échantillon, sélectionnez au moins cinq champs de vision (FOV) et acquérez des images dans chaque canal approprié à l’aide des paramètres d’acquisition (voir les exemples de la figure 2). Enregistrez les points XY de chaque FOV afin que le même FOV puisse être imagé pendant le point temporel final. L’imagerie du même FOV à chaque point temporel est nécessaire pour déterminer la proportion de surface occupée par les cellules cibles ou inhibitrices lors des étapes d’analyse.
   note: Dans cet exemple, la fluorescence de la GFP est détectée à l’aide d’un filtre avec une longueur d’onde d’excitation de 467 à 498 nm et un filtre d’émission de 513 à 556 nm et est de fausse couleur verte. La fluorescence de dsRed est détectée à l’aide d’un filtre avec une longueur d’onde d’excitation de 542 à 582 nm et un filtre d’émission de 603 à 678 nm et est de couleur magenta fausse.
4. Après 2 h, répétez l’étape ci-dessus pour chaque échantillon en utilisant les points XY précédemment enregistrés (Figure 2).
   note: Il peut être nécessaire d’optimiser le moment des images subséquentes pour des organismes ayant des taux de croissance ou des mécanismes de compétition différents.

Résultats

Figure 1 : Préparation du tampon d’agarose et configuration de la lame pour les tests de coïncubation. (A) Configuration pour la fabrication de tampons d’agarose à 2 %. Cinq couches de ruban adhésif de laboratoire (vert) sont enroulées autour d’une lamelle à deux points espacés d’environ 20 mm. Ensuite, de l’agarose chaude à 2 % dans une solution saline marine tamponnée au pho...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tube de microcentrifugation de 1,5 mL	pêcheur	Tél. : 05-408-129
Pipette monocanal de 10 μL
Pipette monocanal 1000 uL
Pipette monocanal de 20 uL
Pipette monocanal de 200 uL
Agarose	pêcheur	BP165-25	Agarose à faible point de fusion
Antenne parabolique Cellvis 35 mm	pêcheur	NC0409658	#1.5 Fond en verre de couverture
chloramphénicol	sigma	Réf. C0378	mère (20 mg/mL dans l’éthanol) ; concentration finale dans le milieu (2 μg/mL LBS)
Logiciel d’analyse d’images FIJI	ImageJ	https://imagej.net/Fiji/Downloads	Logiciel open source
Fisherbrand Lunettes de protection : Cercles	pêcheur	12-545-81P	Verre de protection #1.5 ; 12 mm de diamètre
Sulfate de kanamycine	pêcheur	Réf. BP906-5	stock (100 mg/mL dans l’eau, stérilisation par filtre) ; concentration finale dans le milieu (1 μg/mL LBS)
Papier de soie de nettoyage d’objectif	pêcheur	Réf. S24530
Plaques de Pétri	pêcheur	FB0875713	stérile avec couvercle
Lames de rasoir	pêcheur	Réf. S65921
Cuvettes semi-micro	VWR	Référence 97000-586
spectrophotomètre
Lames de microscope uni Thermo Scientific Gold Seal	pêcheur	12-518-100B
Thermo Scientific Richard-Allan Scientific Verre de protection	pêcheur	Tél. : 22-050-235	Verre de protection #1.5, 25 mm2
Huile d’immersion de type F	pêcheur	NC0297589
Microscope à fluorescence droit ou inversé avec caméra et logiciel d’imagerie			Les images de cet article ont été acquises à l’aide d’un microscope à fluorescence inversée Nikon TI-2 équipé d’une caméra CMOS numérique ORCA-Fusion à l’aide du logiciel NIS-Elements.
tourbillon
Bain-marie			Utilisé pour garder l’agarose au chaud avant le pipetage
Médias LBS
Tampon Tris 1M (pH ~7,5)			50 mL de tampon de stock de 1 m (62 mL HCl, 938 mL d’eau DI, 121 g de base Trizma)
Technique Agar	pêcheur	Référence : DF0812-17-9	15 g (Ajouter uniquement pour les assiettes)
Eau DI			950 ml
chlorure de sodium	pêcheur	S640-3	20 grammes
Tryptone	pêcheur	BP97265	10 grammes
Extrait de levure	pêcheur	BP9727-2	5 grammes
mPBS (PBS marin)			Solution saline tamponnée au phosphate avec ajout de sels marins ; utilisée pour la fabrication de tampons d’agarose
10 fois le PBS	pêcheur	ICN1960454
Sel de mer de mer instantané	Océan instantané	SS1-160P	Ajustez la concentration à la salinité appropriée ; 20 psu utilisés ici
Unités de filtration sous vide stériles	pêcheur	SCGVU01RE	Utilisé pour filtrer et stériliser le mPBS
Pompe à vide			Utilisé pour filtrer et stériliser le mPBS