Amplified luminescent Proximity Homogeneous Assay : Un test de proximité basé sur des billes pour cribler de petites molécules inhibant les interactions protéine-protéine

Résumé

Source : Wang, L. et al., Études des interactions chaperon-cochaperon à l’aide d’un essai homogène basé sur des billes. J. Vis. Exp. (2021)

Dans cette vidéo, nous démontrons le test homogène de proximité luminescent amplifié, un test de proximité basé sur des billes. Il utilise des billes accepteuses et donneuses de taille homogène, immobilisées avec deux protéines qui ont tendance à interagir pour cribler les petites molécules potentielles inhibant les interactions protéiques.

Protocole

REMARQUE : La figure 1 présente une vue d’ensemble de ce protocole.

1. Expression et purification de GST-FKBP51 et GST-FKBP52 (Figure 1A)

1. Plasmides
   REMARQUE : Obtenez des clones d’ADNc pour l’humain FKBP51 (identifiant du clone : 5723416) et pour l’humain FKBP52 (identifiant du clone : 7474554) auprès du consortium IMAGE.
   1. Amplifier l’ADN humain FKBP51 par PCR avec des amorces (en avant ; 5'GGATCCATGACTACTGATGAAGGT-3', en arrière ; 5'-CTCGAGCTATGCTTCTGTCTCCAC-3') contenant des surplombs BamHI et XhoI et cloner en vecteur pGEX6-1 aux sites de restriction BamHI / XhoI.
   2. Amplifier l’ADN humain FKBP52 par PCR avec des amorces (en avant ; 5'-GAATTCATGAGCCGAGGAGATG-3', en marche arrière ; 5'-CTCGAGCTATGCTTCTGTCTCCAC-3') contenant des surplombs EcoRI et XhoI et cloner en vecteur pGEX6-2 sur les sites de restriction EcoRI / XhoI.
      note: La configuration et les conditions de la réaction PCR sont indiquées dans les tableaux 1 et 2.
   3. Vérifier la séquence insérée et transformer les plasmides en E. coli chimiquement compétent selon le protocole de fabrication.
2. Expression et purification des protéines
   1. Ajoutez 25 g de base de bouillon Luria (LB) dans 1 L d’eau distillée pour préparer la solution LB. Autoclave à 121 °C pendant 15 min. Après refroidissement, ajouter 50 μg/mL d’ampicilline.
   2. Prendre une colonie de bactéries exprimant GST-FKBP51 ou GST-FKBP52 et mélanger avec 500 μL de solution de LB dans un tube de 1,5 mL. Tourbillon.
   3. Ajouter le mélange de « 1.2.2 » dans 1 L de solution de LB dans l’erlenmeyer recouvert d’une feuille d’aluminium. Incuber l’erlenmeyer dans l’agitateur pendant une nuit à 37 °C.
   4. Induire l’expression des protéines en ajoutant 1 mM d’isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) dans l’erlenmeyer et poursuivre l’incubation pendant 2 h supplémentaires.
   5. Pour obtenir des granulés de cellules, centrifugez à 5 000 x g pendant 15 min. Retirez le surnageant.
      note: Les granulés de cellules peuvent être conservés à -20 °C.
   6. Remettre les pastilles en suspension dans 40 mL de PBS et sonicate 3 x 20 s sur de la glace. Ajouter 1 mM de PMSF, 1 mM d’EDTA et un cocktail d’inhibiteurs de protéase (1 comprimé) pour prévenir la protéolyse.
   7. Centrifuger la suspension pendant 30 min 50 000 x g pour éliminer les débris cellulaires et appliquer le surnageant sur une colonne de piège GST de 5 mL.
   8. Après avoir lavé la colonne avec 30 mL de PBS, éluez GST-FKBP51 et GST-FKBP52 avec 5 mL de 10 mM de glutathion dans du PBS.
   9. Concentrer les protéines sur une unité de centrifugation de 15 mL 10.000 MWCO. Pour éliminer le glutathion libre, faites passer les concentrés dans la colonne-10 équilibrée avec 0,5x PBS et concentrez-vous à nouveau sur le dispositif de centrifugation à filtre.
   10. Recueillir les fractions contenant des protéines. Vérifiez les protéines dans SDS-PAGE et ajustez les concentrations de protéines à 1 mg/mL.
       note: Le rendement typique en protéines est de 2 à 5 mg/L de culture. La protéine peut être stockée à -20 °C.

2. Couplage du peptide C-terminal Hsp90 aux billes de l’accepteur (Figure 1B)

1. Préparation peptidique Hsp90
   1. Synthétiser le peptide de dix acides aminés NH 2-EDASRMEEVD-COOH correspondant aux acides aminés 714-724 de l’isoforme bêta Hsp90 humaine (UniProt ID : P08238) par un service de synthèse peptidique.
   2. Diluer le peptide Hsp90 dans du PBS à une concentration de 1 mg/mL.
2. Préparation des billes d’accepteur
   1. Diluer les billes accepteuses non conjuguées dans du PBS à une concentration de 1 mg/mL et transférer dans un tube de 1,5 mL.
   2. Effectuez le lavage par centrifugation à 16 000 x g pendant 15 min. Retirez soigneusement le surnageant.
3. conjugaison
   1. Définissez le rapport entre les billes et le peptide à 10:1. Dans le tube de 1,5 mL contenant 1 mg de pastille de bille d’accepteur (préparée comme décrit ci-dessus), ajouter 1 mL de PBS (pH 7,4), 0,1 mg de peptide dilué, 1,25 μL de Tween-20, 10 μL d’une solution de 400 mM de cyanoborohydrure de sodium (NaBH₃CN) dans l’eau.
      prudence: Le NaBH₃CN est toxique ; Utilisez une hotte et des gants. La solution de NaBH₃CN doit être fraîchement préparée.
   2. Incuber pendant 24 h à 37 °C avec agitation de bout en bout (10-20 tr/min) sur un agitateur rotatif.
4. Trempe par réaction et lavage des billes
   1. Ajouter 20 μL de solution de Tris-HCl 1 M (pH 8,0) à la réaction pour bloquer les sites n’ayant pas réagi. Incuber pendant 1 h à 37 °C.
   2. Centrifuger à 16 000 x g (ou vitesse maximale) pendant 15 min à 4 °C. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille de billes dans 1 mL de solution de Tris-HCl (100 mM, pH 8,0).
   3. Répétez l’étape de lavage trois fois.
   4. Après la dernière centrifugation, remettre les billes en suspension à 1 mg/mL dans un tampon de stockage (1 mL de PBS 0,5 × avec 0,01 % d’azoture de sodium comme agent de conservation). Stocker la solution de billes d’accepteur conjuguées à 4 °C à l’abri de la lumière.
      prudence: L’azoture de sodium est toxique ; Utilisez une hotte et des gants.

3. Le test sondant l’interaction entre GST-FKBP51 ou GST-FKBP52 et le peptide C-terminal Hsp90, et l’inhibition avec des composés de faible masse moléculaire (Figure 1C)

1. Protéines marquées GST interagissant avec les billes donneuses de glutathion
   1. Placez les réactions dans des plaques de 384 puits.
   2. Préparez la solution contenant 10 μg/mL de billes donneuses de glutathion dans du PBS 0,5x, pH 7,4.
      note: Après un stockage prolongé, les billes se déposent et doivent être vortexées.
   3. Ajouter GST-FKBP51 ou GST-FKBP52 à une concentration finale de 10 μg/mL.
   4. Incuber dans l’obscurité à 25 °C pendant 10 min
      note: À cette étape, les protéines marquées GST vont interagir avec le glutathion attaché aux billes. Pour chaque puits, 22,5 μL de ce mélange seront utilisés. La concentration des partenaires de liaison doit être déterminée empiriquement. Titrez GST-FKBP51 et GST-FKBP52 et choisissez la concentration qui donne le meilleur signal.
2. Addition de composés
   1. Effectuer des dilutions en série des composés d’essai dans DMSO.
      note: Les concentrations utilisées sont généralement de 10, 30, 100, 300, 1 000 et 3 000 μM.
   2. Ajouter 0,25 μL de DMSO (témoin négatif) ou de peptide C-terminal Hsp90 (témoin positif, 30 μM) ou de composés de DMSO dans le coin de chaque puits de la plaque. Utilisez des triplets pour chaque concentration de composé.
   3. Ajouter 22,5 μL de la solution contenant des billes donneuses de glutathion avec des protéines marquées GST dans chaque puits.
   4. Secouez doucement l’assiette avec la main mais soigneusement. Incuber dans l’obscurité à 25 °C pendant 15 min
      note: Pendant ce temps, les composés interagiront avec le domaine TPR au site de liaison du peptide C-terminal Hsp90.
3. Ajout de perles d’accepteur
   1. Diluez les billes de l’accepteur avec le peptide C-terminal Hsp90 attaché à 100 μg/mL dans 0,5x PBS.
   2. Ajouter 2,25 μL de billes d’accepteur diluées dans chaque puits.
   3. Mélangez doucement mais soigneusement. Incuber dans l’obscurité à 25 °C pendant 15 min
      note: À cette étape, les billes donneuse et accepteuse sont rapprochées par les interactions protéine-peptide. Le volume final du mélange réactionnel est de 25 μL. Par conséquent, les concentrations finales des composés varient de 0,1 à 30 μM.
4. Lecture de plaques
   note: Lire la plaque à l’aide d’un lecteur de plaque réglé dans le mode approprié.
   1. Allumez l’instrument et ouvrez le logiciel
   2. Choisissez le protocole approprié.
   3. Cliquez sur Modifier la carte de la plaque et sélectionnez le puits utilisé dans la plaque pour la mesure.
   4. Cliquez sur Suivant pour continuer et exécuter le protocole sélectionné.
   5. Après la mesure, cliquez sur Afficher les résultats pour afficher les résultats.
   6. Exportez les données.

Tableau 1 : Réaction PCR mise en place pour l’amplification de l’ADN humain FKBP51 et FKBP52.

Composant de réaction	Volume (μL)
Tampon PCR (5 x concentré)	4
Apprêt avant	1
Amorce inversée	1
plasmide	0,5
Mixage dNTP (10 mM chacun)	0,5
Phusion ADN polymérase	0,5
Eau (grade ADN)	12,5
total	20

Tableau 2 : Conditions thermocycliques pour l’amplification de l’ADN humain FKBP51 et FKBP52.

étape	Température (°C)	Heure	Cycles
Dénaturation initiale	94	3 minutes	1
dénaturation	94	30 secondes	35
recuit	56	30 secondes
extension	72	1 minute
Extension finale	72	Durée : 5 minutes	1
Remarque : La température du couvercle est de 105 °C.

Résultats

Figure 1 : Schéma de ce protocole. (A) Expression et purification de GST-FKBP51 et GST-FKBP52. (B) Couplage du peptide C-terminal Hsp90 aux billes de l’accepteur. (C) Le test sondant l’interaction entre GST-FKBP51 ou GST-FKBP52 et le peptide C-terminal Hsp90. Inhibition avec des composés de faible masse moléculaire.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plaques à 384 puits	Perkin Elmer	6008350	Volume d’analyse 25 ml
Unité de centrifugation Amicon 10.000 MWCO	Millipore	UFC901008	Concentré de protéines
Ampicilline	sigma	A0166	Antibiotiques
Agitateur de bactéries Unimax 1010	Heidolph		Bactéries de culture
Clones d’ADNc pour FKBP51 humain	Source : BioScience	ID de clone : 5723416	vecteur pCMV-SPORT6
Clones d’ADNc pour FKBP52 humain	Source : BioScience	ID du clone : 7474554	vecteur pCMV-SPORT6
E. coli chimiquement compétent	Invitrogen	C602003	One Shot BL21 Star (DE3)
Dmso	Supelco	Référence 1.02952.1000	Composés dilués
Le	Gibco	Référence 14190 à 144	Préparer la solution
Edta	Calbiochimie	344504	Prévenir la protéolyse pendant la sonication
glutathion	sigma	G-4251	Éluer des protéines marquées GST
Perles donneuses de glutathion	Perkin Elmer	Référence 6765300	Perle de donneur
Colonne piège GST	Cytiva (GE Healthcare)	17528201	Purifier les protéines marquées GST
Isopropyl-β-D-thiogalactoside	Thermo Fisher Scientific	Réf. R0392	Induire l’expression des protéines
Bouillon LB (Miller)	sigma	N° L3522	Milieu de croissance microbienne
Instrument PCR	BIO-RAD	Thermocycleur S1000	Amplification/PCR
Colonne-10	Cytiva (GE Healthcare)	17085101	Échange de solutions
vecteur pGEX-6P-1	Cytiva (GE Healthcare)	28954648	plasmide
vecteur pGEX-6P-2	Cytiva (GE Healthcare)	28954650	plasmide
Lecteur de plaques	Perkin Elmer	Lecteur multi-étiquettes EnSpire 2300	Lire la plaque alpha
Logiciel de lecture de plaques	Perkin Elmer	Gestionnaire EnSpire	Logiciel de lecture de plaques
Protocole logiciel du lecteur de plaques	Perkin Elmer	Alpha 384-well Faible volume	Utilisez ce protocole pour lire la plaque
PMSF	sigma	P7626	Prévenir la protéolyse pendant la sonication
Cocktail d’inhibiteurs de protéase	sigma	S8830	Prévenir la protéolyse pendant la sonication
Azoture de sodium	sigma	S2002	En tant que conservateur
Cyanoborohydrure de sodium (NaBH3CN)	sigma	156159	Active la matrice pour le couplage
Peptide de dix acides aminés NH2-EDASRMEEVD-COOH correspondant aux acides aminés 714-724 de l’isoforme bêta Hsp90 humaine	Peptide 2.0 inc		Synthétiser le peptide C-terminal Hsp90
Rotateur de tube à essai	LABINCO		Faites de l’agitation de bout en bout
Tris-HCl	sigma	10708976001	Bloquer les sites n’ayant pas réagi des billes d’accepteur
Préadolescent-20	sigma	Réf. P1379	Empêcher l’agrégation des billes
Ultra centrifugeuse Avanti J-20 XP	Beckman Coulter		Centrifugeuse pour obtenir des granulés de cellules bactériennes
Perturbateur de cellule à ultrasons	Microson		Cellules sonicates pour libérer des protéines
Perles d’accepteur non conjuguées	Perkin Elmer	6762003	Perles d’accepteur
Mini-cellule XCell SureLock et module de transfert XCell II	Invitrogen	EI0002	PAGE DE DONNÉES DE SÉCURITÉ