1. Ensemencement des cellules Vero
- La veille du début du test de plaque, trypsinisez les cellules Vero et mettez-les en suspension dans le milieu DMEM (Modified Eagles Medium) de Dulbecco (DMEM) régulier et complétez selon la méthodologie de culture cellulaire standard. Remettre en suspension les cellules trypsinisées dans 10 mL de DMEM par fiole T-75 des cellules Vero confluentes (~107 cellules).
REMARQUE : Le DMEM est utilisé pour les tests sur plaque au lieu de l’alpha-MEM car il ralentit légèrement le taux de croissance cellulaire et favorise de meilleurs résultats de test sur plaque.
- Comptez les cellules selon la méthode de votre choix (p. ex., un hémocytomètre standard à l'exclusion du bleu trypan).
- Ensemencer les cellules à raison de 4 x 106 cellules/plaque ; pour le HSV-2, utiliser des plaques à 6 puits avec 2,5 mL de DMEM (avec suppléments) par puits ; et pour le HSV-1, utiliser des plaques à 12 puits avec 1,25 mL de DMEM (avec suppléments) par puits.
REMARQUE : Le nombre de cellules doit être constant quelle que soit la plaque utilisée, bien que la taille des puits soit importante pour la précision du dosage des plaques. Il est essentiel d’obtenir une répartition uniforme des cellules, ce qui peut être accompli plus efficacement en déplaçant la plaque d’avant en arrière, et non de manière circulaire.
- Laisser les cellules se développer pendant la nuit à 37 °C/5 % CO2 dans un incubateur humidifié.
REMARQUE : L’humidité est maintenue avec une casserole d’eau distillée contenant un algicide au fond de l’incubateur.
2. Dilution de l’échantillon
- Terminez la dilution de l’échantillon et l’ajout du virus aux cellules en une seule séance de laboratoire.
ATTENTION : Les HSV-1 et -2 sont infectieux pour les humains et doivent être manipulés dans un confinement de biosécurité approprié (BSL-2). Séparez toutes les matières qui entrent en contact avec le virus et désinfectez-les à l’aide d’un agent quaternaire à dilution de 1/256 (voir le tableau des matières), d’iodophore, d’eau de Javel ou d’un détergent ionique fort (p. ex., SDS) avant de les retirer de l’enceinte de sécurité biologique.
- Le lendemain de l’ensemencement des cellules Vero, diluez en série chaque échantillon de virus à placer dans 1x PBS ; utilisez généralement des dilutions 10 fois pour le suivi le plus précis.
- Effectuer ces dilutions par 10-4 (pour les faibles concentrations de virus) ou par 10-9 (pour les échantillons à titre plus élevé) avec au moins 1 mL de chaque échantillon restant pour le test de plaque lui-même.
- Conservez toutes les dilutions virales sur de la glace (pas plus de 1 h) jusqu’au moment d’ajouter ces échantillons de virus dilués aux cellules.
3. Ajout de virus aux cellules
- Prélever le milieu de culture cellulaire d’un ou deux puits à l’aide d’une pipette.
REMARQUE : N’utilisez pas d’aspirateur car il enlève trop de liquide de la monocouche cellulaire et assèche les cellules. Une considération cruciale est de s’assurer que la monocouche cellulaire reste hydratée tout au long de l’expérience. Si les cellules se dessèchent, elles se détacheront de la plaque lors de la dernière étape et généreront des données inutilisables. Par conséquent, ne traitez qu’un ou deux puits à la fois pour réduire cette possibilité.
- Ajouter délicatement l’échantillon de virus dilué (100 à 400 μL et 50 à 200 μL d’échantillon de virus sont utilisés pour les plaques à 6 puits et à 12 puits, respectivement) goutte à goutte à chaque monocouche, en ajoutant les gouttes sur le côté de chaque puits. Répétez le processus pour un ou deux puits jusqu’à ce que toute la plaque soit remplie des échantillons de virus en plaque.
REMARQUE : L’ajout des gouttes au centre du puits peut par inadvertance détacher des cellules du substrat.
- Secouez doucement toute la plaque à la main pour vous assurer que le PBS qui contient le virus recouvre toute la monocouche de cellules de chaque puits, puis placez la plaque dans un incubateur de CO2 à 37 °C pour permettre au virus de s’adsorber.
- Toutes les 10 minutes dans les 1 h, retirez la plaque de l’incubateur, secouez-la doucement à nouveau pour répartir le virus plus uniformément dans chaque puits, puis remettez-la dans l’incubateur.
REMARQUE : Chaque expérience dictera le nombre de répétitions et les dilutions utilisées ; La préférence du lecteur dicte cette décision.
- Pour réduire la possibilité de compter par inadvertance l’inoculum non absorbé, prélevez l’échantillon de virus des puits avec des pointes de pipette de 1000 μL et placez-le dans un bécher à déchets.
REMARQUE : Encore une fois, cette procédure est effectuée avec seulement un ou deux puits à la fois pour maintenir l’hydratation de la monocouche cellulaire.
- Placez 2,5 mL d’un revêtement de méthylcellulose (dissoudre 5 % de méthylcellulose p/p dans 100 mL de PBS, autoclave pendant 15 min à 121 °C et 15 psi sur un cycle liquide, puis ajouter 375 mL de DMEM plus 25 mL de FBS).
- Une fois qu’une plaque entière contient un rebordement, remettez-la dans l’incubateur pour permettre sa croissance pendant deux jours.
REMARQUE : Si le virus et les cellules sont laissés se développer pendant trois jours, même dans les suppléments de DMEM plus, une perte substantielle de cellules dans la monocouche peut en résulter, compromettant ainsi les données finales.
- Désinfectez le bécher à déchets, généralement avec l’ajout d’eau de Javel, d’un iodophore ou d’un virucide similaire, avant de le retirer de l’enceinte de biosécurité.
4. Coloration des plaques
- Après l’incubation de deux jours, retirez la couche de méthylcellulose à l’aide d’une pipette, à nouveau un ou deux puits à la fois, et placez-la dans un bécher à déchets.
- Ajouter ~2 mL de violet cristallin à 1 % (voir le tableau des matériaux) dans de l’éthanol à 50 % dans chaque puits pour colorer les plaques.
REMARQUE : Il n’est pas essentiel d’enlever chaque dernière goutte de la superposition.
- Incuber la plaque avec tous les puits remplis de colorant pendant 30 min à 37 °C. À ce stade, désinfectez le gobelet à déchets comme ci-dessus à l’étape 3.8.
- Lavez vigoureusement les assiettes à l’eau du robinet jusqu’à ce que les eaux de ruissellement soient claires.
REMARQUE : Un léger jet d’eau n’est pas assez vigoureux ; La pression maximale d’un appareil d’évier de laboratoire est requise.
- À ce stade, assurez-vous qu’il y a des différences d’environ 10 fois dans le nombre de plaques dans chaque série de dilution.
- Laissez les plaques sécher pendant la nuit à l’envers, après quoi les plaques individuelles peuvent être comptées.
