Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Dosage TUNEL
- Euthanasier les animaux qui présentent des signes cliniques de chytridiomycose et un nombre égal d’animaux témoins Bd négatifs.
- Disséquer des échantillons de peau (dorsale, ventrale et cuisse) de chaque animal. Fixer les échantillons de peau pendant 2 h dans du formaldéhyde tamponné au phosphate à 4 % v/v. Le temps de fixation court et constant permet aux tissus d’être entièrement fixés, mais permet également une coloration immunohistochimique efficace et précise. Transférer ensuite à 80 % d’éthanol jusqu’à l’enrobage pour le sectionnement.
- Incorporer la peau dans de la cire de paraffine pour une préparation histologique selon les méthodes standard. En bref, le protocole est le suivant :
- Déshydratez les tissus dans une série graduée d’éthanol et éliminez l’éthanol avec du xylène. Incorporez le tissu dans de la cire de paraffine et placez les trois échantillons de peau de chaque individu dans un bloc de paraffine.
- Sectionner la peau à l’aide d’un microtome en suivant une préparation histologique standard. Sectionnez le tissu en série à 5 μm, puis fixez-le sur des lames de verre hydrophiles. Placez quatre histosections en série par type de peau et par lame. Faites trois lames par individu avec des coupes de peau en série, rappelez-vous que chaque lame a quatre sections de chaque tissu fixées.
- Colorez les lames dans l’ordre suivant :
- Teindre la première lame avec de l’hématoxyline suivie d’une contre-coloration à l’éosine (H&E). Cette diapositive permet de visualiser l’emplacement des sporanges Bd dans la peau.
- Colorez la deuxième lame après un test TUNEL disponible dans le commerce pour la préparation histologique et suivez les instructions du fabricant, qui sont décrites ci-dessous.
- Tout d’abord, déparaffinisez les sections de tissu dans un bocal en lavant les lames avec trois changements de xylène pendant 5 minutes par lavage, puis avec deux changements d’éthanol à 100 % pendant 5 minutes à chaque lavage. Poursuivez avec un lavage d’éthanol à 95 % pendant 3 min, puis d’éthanol à 70 % pendant 3 min. Terminez par un lavage de PBS pendant 5 min.
- Prétraitez le tissu avec une enzyme de digestion des protéines fraîchement diluée (protéinase K à une concentration de 20 μg/mL diluée dans du PBS) et ajoutez-le directement à la lame. Laisser incuber pendant 15 min. Laver avec deux changements de PBS dans un bocal coplin pendant 2 min chacun.
- Tapotez l’excès de liquide et trempez dans du peroxyde d’hydrogène à 3,0 % dans du PBS dans un bocal à coplin pendant 2 minutes à température ambiante. Rincez deux fois avec du PBS, pendant cinq minutes à chaque lavage.
- Tapotez l’excès de liquide, puis appliquez 75 μL/5 cm2 du tampon d’équilibre directement sur le tissu de la lame. Incuber pendant 10 s. Tapotez l’excès de liquide autour de la section et appliquez 55 μL/5 cm2 d’enzyme désoxynucléotidyltransférase terminale (TdT) de travail. Incuber dans une chambre humidifiée pendant 1 h à 37 °C.
- Après l’incubation du TdT, placez la lame dans un bocal coplin de tampon d’arrêt/lavage de force de travail, agitez pendant 15 secondes et incubez pendant 10 minutes à température ambiante. Lavez la diapositive avec trois changements de PBS pendant 1 min par lavage. Tapotez l’excès de liquide.
- Appliquer sur le tissu un conjugué anti-digoxigénine (rhodamine) réchauffé à température ambiante, 65 μL/5 cm2. Incuber dans une chambre humidifiée pendant 30 min à température ambiante et éviter l’exposition à la lumière. Laver avec quatre changements de PBS pendant 2 min par lavage. Tapotez l’excès de liquide.
- Terminez en ajoutant 15 μL de DAPI (4',6-diamidino-2-phénylindole) de 0,5 à 1 μg/mL dans un support de montage sur lame, qui agit comme une contre-teinture. Ensuite, couvrez avec une lamelle de recouvrement et scellez avec du vernis à ongles ou du ciment caoutchouc. Laissez les lames sécher dans l’obscurité car le test est sensible à la lumière.
- Colorer la troisième lame à l’aide du test TUNEL et de la contre-coloration DAPI, mais utiliser comme témoin positif et négatif pour chaque échantillon.
REMARQUE : Sur les 4 histosections des lames de contrôle, les 2 premières sont des réplicats de contrôle positif et les 2 dernières sont des réplicats de contrôle négatif.
- Pour les témoins positifs, au lieu de l’étape 1.5.2.2, prétraiter le tissu avec un tampon DN (30 mM de base trizma, pH 7,2, 4 mM de MgCl2, 0,1 mM de DDT) et laisser incuber à température ambiante pendant 5 minutes. Dissoudre ensuite la Dnase I dans le tampon DN pour obtenir une concentration finale de 0,1 μg/mL, et l’appliquer directement sur la lame. Incuber pendant 15 minutes à température ambiante, puis laver la lame avec 5 lavages de dH2O pendant 3 minutes à chaque lavage. Épongez l’excès de liquide. Reprendre ensuite l’essai TUNEL comme indiqué à la section 1.5.2.3.
- Pour les témoins négatifs, n’ajoutez pas l’enzyme terminale désoxynucléotidyltransférase (TdT) à ces échantillons (comme décrit à la section 1.5.2.4).
2. Observez les lames TUNEL immédiatement après la fin du test.
- Prenez des photos à intervalles aléatoires le long de chaque section de peau à 200X à l’aide d’un microscope fluorescent, en utilisant des filtres pour la coloration à la rhodamine, qui révèle les cellules apoptotiques et apparaît en rouge, et le DAPI qui révèle tous les noyaux et apparaît en bleu, afin qu’une superposition de cellules puisse être générée. Assurez-vous qu’au moins 100 cellules sont photographiées par section de peau et par échantillon. Conservez les lames dans une boîte de microscope sombre à -20 °C.
- Comptez les cellules (colorées en bleu DAPI) par image. Assurez-vous qu’au moins 100 cellules sont comptées par section de peau. Pour atteindre 100 cellules, comptez toutes les cellules de l’image. Si moins de 100 cellules sont présentes dans une image, comptez une autre image jusqu’à ce qu’au moins 100 cellules soient atteintes par section de peau et par animal.
- Ensuite, comptez le nombre de cellules TUNEL-positives dans les mêmes images (colorées à la rhodamine rouge). Les cellules positives à TUNEL, qui indiquent l’apoptose et non la nécrose ou le fond, sont des cellules uniques avec des bords cellulaires clairs (les membranes sont intactes sans lyse). Parfois, les cellules rétrécissent pour former des corps apoptotiques.
- Localisez les zones comptées dans le test TUNEL et analysez les régions correspondantes sur les histosections colorées H&E. Confirmer que les sections colorées à H&E correspondent aux sites d’infection à Bd, ce qui garantit que les sites infectés par Bd sont utilisés lors du comptage des cellules apoptotiques dans le test TUNEL.
