Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Élevage et surveillance des animaux
- Hébergez les animaux individuellement, dans un environnement adapté à l’espèce, avec un horaire approprié d’eau, d’alimentation et de nettoyage. Vérifiez les animaux tous les jours.
- Utiliser des individus adultes de Litoria verreauxii alpina (pour l’essai de caspase 3/7, section 4), donnés par des installations d’élevage en captivité. Maintenez les animaux à 15 - 18 °C, sur un substrat de mousse et de gravier, vaporisez-les quotidiennement avec de l’eau d’osmose inverse et nourrissez-les 3 fois par semaine avec des grillons chargés d’intestin.
- Collectez des données sur chaque individu une fois par semaine. Écouvillonner les individus pour le Bd comme décrit à l’étape 2.1. Pesez chaque animal à près de 0,1 g à l’aide d’une balance et mesurez la longueur de son museau à son évent (SVL) à 0,01 mm près à l’aide d’un pied à coulisse.
- Après l’inoculation (comme décrit à la section 3), vérifier quotidiennement les animaux pour détecter les signes cliniques d’infection (desquamation cutanée irrégulière, inappétence, rougeur des pattes, léthargie ou réflexe de redressement retardé) conformément aux directives d’éthique animale. Euthanasier les animaux en présence de signes cliniques et de morbidité.
- Euthanasier avec une surdose de méthanesulfonate de tricaïne (MS222) (0,1 % p/v MS222 à pH 6 - 7 avec du bicarbonate de sodium dans de l’eau du robinet vieillie). Gardez les animaux dans MS222 pendant 10 minutes après que tout mouvement a cessé et qu’ils ne montrent aucune réponse aux stimuli.
2. Test d’infection Bd
- Écouvillonnage pour Bd
- Écouvillonnez chaque animal avec un nouvel écouvillon de rayonne stérile (un écouvillon par animal). Utilisez la méthode d’écouvillonnage suivante : cinq fois sur l’aérateur et cinq fois sur chaque cuisse, côté et membre. Cela représente un total de 45 coups.
- Faites pivoter doucement l’écouvillon pendant et entre les traits pour assurer une capture efficace de l’ADN. Casser l’extrémité de l’écouvillon dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL et conserver à -20 °C jusqu’à l’extraction.
- Extraction d’ADN et test qPCR
- Extrayez l’ADN génomique des écouvillons en ajoutant 50 μL d’un réactif d’extraction d’ADN disponible dans le commerce avec 30 à 40 mg de billes de silice de 0,5 mm. Battez les échantillons dans un perturbateur de cellule de battage de billes à vitesse maximale pendant 2 min. Après l’étape du batteur de billes, centrifugez les échantillons à 2 000 x g pendant 1 min.
- Incuber les échantillons à 100 °C pendant 10 min et les laisser refroidir. Centrifugez les échantillons à 5 000 x g pendant 3 min, puis transférez le surnageant dans des tubes de microcentrifugation individuels de 1,5 mL et conservez-le à -20 °C jusqu’à la qPCR.
- Utilisez la PCR quantitative (qPCR) selon Boyle et al. 2004 pour analyser la charge d’infection. Utilisez les modifications suivantes :
- Diluer les échantillons d’extraction d’ADN 6:100 avec de l’eau double désionisée. Ajoutez 0,7 μL d’albumine sérique bovine (BSA) dans chaque puits pour aider à prévenir l’inhibition de la PCR. Exécutez chaque échantillon séparément. Sur chaque plaque, utilisez un témoin négatif (sans modèle) et un témoin positif avec une série d’étalons de dilution pour estimer la charge de zoospores (infection).
3. Inoculation
- Culture Bd
- Préparez le bouillon de culture en ajoutant 16 g de tryptone, 2 g d’hydrolysat de gélatine et 4 g de lactose (TGHL) à 1 L d’eau déminéralisée. Autoclave (121 °C pendant 40 min) et laisse refroidir le bouillon.
- Inoculer l’isolat de Bd (dans ce cas, isolé de l’isolat de Nouvelle-Galles du Sud, AbercrombieR-L.booroologensis-2009-LB1, numéro de passage 11) dans un bouillon TGHL et faire croître pendant 7 jours à 23 °C, puis transférer la culture en bouillon sur des plaques de gélose TGHL.
- Pour faire des plaques, ajoutez 16 g de tryptone, 2 g d’hydrolysat de gélatine, 4 g de lactose (TGHL) et 10 g de gélose bactériologique à 1 L d’eau déminéralisée et d’autoclave (121 °C pendant 40 min). Une fois que le mélange est suffisamment froid pour être touché au toucher, mais avant qu’il ne se solidifie, versez la gélose TGHL dans des plaques de culture de 92 mm de diamètre de manière à ce qu’elles soient pleines de 1/4 à 1/3, dans une enceinte de sécurité biologique de classe II.
- Lorsque la gélose s’est solidifiée et refroidie complètement, inoculez chaque plaque avec 0,5 mL de Bd du bouillon liquide et étalez-la uniformément. Laisser sécher le mélange de bouillon Bd sur une assiette pendant environ 1 h, puis sceller les assiettes avec un film de paraffine plastique. Incuber les plaques face gélose vers le bas à 23 °C pendant 5 à 7 jours.
- Plaques d’inondation pour solution d’inoculation de zoospores
- Vérifiez quotidiennement la motilité des zoospores à l’aide d’un microscope à lumière inversée pour s’assurer de leur viabilité avant l’inoculation. Lorsque la libération de zoospores est élevée, avec de nombreuses zoospores nageant à l’extérieur des sporanges, la culture est prête pour l’inoculation.
- Inondez chaque assiette avec 3 ml d’eau du robinet vieillie ou d’eau d’étang artificiel, en versant l’eau dans la plaque et en l’incubant à température ambiante pendant 10 minutes pour permettre aux zoospores de se libérer dans l’eau. Après la période d’incubation, décantez la suspension de zoospores dans un nouveau récipient stérile.
- Estimez la concentration de zoospores en suivant les instructions du fabricant à l'aide d'un hémocytomètre. Une fois que la concentration de la suspension de zoospores est connue, diluer la suspension à une concentration de 1 x 106 zoospores par 3 mL avec de l’eau du robinet vieillie.
- Vacciner les animaux
- Inoculer chaque animal en versant 3 mL de mélange d’inoculum sur son ventre dans des contenants individuels de 50 mL. Laissez l’excès d’inoculum s’accumuler dans la base du récipient d’inoculation. Laissez chaque animal dans un contenant d’inoculation individuel pendant 24 h pour assurer l’infection, et après l’inoculation de 24 h, retournez chaque individu dans un terrarium désinfecté.
- Désinfectez les terrariums à l’aide d’une solution d’eau de Javel commerciale à 13 % volume/volume (v/v), rincez-les au moins deux fois à l’eau, puis laissez-les sécher pendant au moins 24 h.
- Pour les témoins négatifs au Bd, inoculer les animaux en utilisant les mêmes méthodes que dans les sections 3.2 et 3.3, mais inoculer les plaques de gélose sans Bd avec 5 mL d’eau du robinet vieillie au lieu de plaques de gélose inoculées au Bd.
4. Dosage de la caspase 3/7
- Prélever les pointes des orteils de chaque animal (exposés au Bd et Bd négatifs) une fois par semaine jusqu’à la 3e semaine après l’inoculation, et toutes les deux semaines jusqu’à la fin de l’expérience, jusqu’à 8 orteils par individu.
- Coupez l’extrémité de l’orteil au niveau de la deuxième phalange à l’aide de ciseaux stérilisés à la flamme, placez-le dans un microtube de 1,5 ml et congelez-le immédiatement à -80 °C.
- Extraire les protéines d’un échantillon d’orteil congelé.
- Placez les échantillons dans 100 μL de tampon d’échantillon (25 mM HEPES pH 7, 5 mM MgCl2) avec deux billes en acier inoxydable (3,2 mm) dans un microtube à bouchon à vis de 1,5 mL. Lyse des échantillons en 4 cycles de 1 min de battement de billes à vitesse maximale (dans le même batteur de talons que celui utilisé à l’étape 1.2.1) suivis de 3 min sur glace. Après lyse, centrifuger les échantillons à 12 000 x g et 4 °C pendant 5 min. Prélever le surnageant à utiliser dans le dosage.
- Quantifiez la concentration en protéines par échantillon à l’aide du test Bradford.
- Dans une plaque de 384 puits, mélanger 10 μL d’extrait de protéines avec 10 μL de réactif Bradford, et incuber pendant 2 min à température ambiante. Effectuez chaque échantillon en double, avec une série d’étalons de dilution BSA 5 fois. Lire l’absorbance à 595 nm sur un lecteur de plaques d’absorbance.
- Par ailleurs, si les échantillons de l’extrémité des orteils sont trop petits (la concentration en protéines est proche de la norme la plus basse déterminée par l’essai de Bradford ou si les grenouilles échantillonnées ont un poids total inférieur à 3 g), normalisez les échantillons en estimant la surface de la peau à l’aide de photographies, au lieu de l’essai de Bradford.
- Avant d’extraire les protéines de l’échantillon pour le dosage de la caspase, photographiez chaque orteil à un grossissement de 40X à l’aide d’un microscope à lumière inversée.
- Analysez l’échantillon d’orteil à l’aide d’un logiciel d’imagerie informatique, en estimant la surface de l’orteil. Pour ce faire, tracez une ligne autour du bord de la pince d’orteil et demandez au logiciel d’imagerie d’estimer la zone à l’intérieur de la forme. Multipliez ensuite cette aire par pi (3.14), ce qui donnera une approximation de la surface de l’échantillon de peau tridimensionnel (comme la longueur x la section transversale (pi x diamètre) donne la surface extérieure d’un tube).
- Effectuez le dosage de la caspase 3/7.
- Dans une plaque de luminescence à 384 puits, ajouter 10 μL de réactif de caspase 3/7 disponible dans le commerce et 10 μL d’extrait de protéine. Exécutez chaque échantillon en trois exemplaires.
- Mélangez les réactifs en secouant lentement la plaque pendant 15 s. Incuber la plaque à l’abri de la lumière pendant 30 min à température ambiante. Mesurez la luminescence à l’aide d’un lecteur de plaques luminescentes.
