Le test de phagocytose : une technique d’immunomarquage pour visualiser l’engloutissement des cellules apoptotiques dans les cellules embryonnaires de Drosophila melanogaster

Résumé

Source : Nonaka, S. et al. Dosage de la phagocytose pour les cellules apoptotiques chez les embryons de drosophile. J. Vis. Exp. (2017).

Cette vidéo démontre une technique d’immunomarquage pour visualiser l’engloutissement des cellules apoptotiques dans les cellules embryonnaires homogénéisées de Drosophila melanogaster. Cette méthode fournit des informations sur la physiologie cellulaire en déterminant l’étendue de l’engloutissement cellulaire apoptotique.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Coloration des hémocytes

1. Immunomarquage avec un anticorps anti-Croquemort
   1. Faire tremper en série les lames de verre dans du méthanol pendant 10 min, dans du PBS contenant 0,2 % (v/v) de Triton X-100 pendant 10 min, puis dans du PBS pendant 10 min.
   2. Monter 20 μL de sérum de porc entier à 5 % (v/v) dans du PBS contenant 0,2 % (v/v) de Triton X-100 sur les cellules pour le bloquer. Incuber les lames à température ambiante pendant 20 min.
   3. Retirer la solution des lames de verre et monter 20 μL d’antisérum anti-Croquemort (0,1 % (v/v)) dans du PBS contenant 0,2 % (v/v) de Triton X-100 sur les cellules. Incuber les lames à 4 °C pendant la nuit.
   4. Faire tremper 5 fois des lames de verre dans du PBS contenant 0,2 % (v/v) de Triton X-100 pendant 10 min.
   5. Faire tremper les lames de verre dans du PBS pendant 10 min.
   6. Monter 20 μL d’IgG anti-rat marquées à la phosphatase alcaline (0,5 % (v/v)) dans du PBS contenant 0,2 % (v/v) de Triton X-100 et 5 % (v/v) de sérum de porc entier sur des cellules à température ambiante pendant 1 h.
   7. Faire tremper 5 fois des lames de verre dans du PBS contenant 0,2 % (v/v) de Triton X-100 pendant 10 min.
   8. Faire tremper les lames de verre dans un tampon contenant 100 mM de Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM de NaCl et 50 mM de MgCl2 pendant 10 min.
   9. Solution de substrat de phosphatase Mount contenant 0,23 mg/mL de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP), 0,35 mg/mL de nitro-bleu tétrazolium (NBT), 100 mM de Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM de NaCl et 50 mM de MgCl₂ sur les cellules.
   10. Observez les cellules au microscope pour une coloration appropriée. Lorsque de forts signaux violets apparaissent dans les granules d’hémocytes, retirer la solution de substrat et tremper les lames de verre dans un tampon composé de 10 mM de Tris-HCl, d’un pH de 8,5 et de 1 mM d’EDTA. Il est recommandé de colorer pendant environ 5 à 10 minutes.

2. Cellules apoptotiques colorées par TUNEL

1. Faire tremper les lames de verre dans du PBS pendant 5 min.
2. Répétez l’opération avec le nouveau PBS.
3. Montez le tampon d’équilibrage (voir le tableau des matériaux) sur les cellules pendant 10 min.
4. Retirer la solution des lames de verre et monter 20 μL de solution TdT contenant 5 μL de désoxynucléotidyl transférase terminale et 15 μL de tampon réactionnel sur les cellules à 37 °C pendant 1 h.
5. Retirer la solution des lames de verre et les faire tremper dans un tampon composé de 0,5 mL de tampon STOP/Wash et de 17 mL d’eau.
6. Faites tremper les diapositives dans PBS pendant 5 minutes 3 fois.
7. Monter 20 μL d’anti-digoxigénine-peroxydase sur des cellules à température ambiante pendant 30 min.
8. Faites tremper les lames de verre dans PBS pendant 5 min 4 fois.
9. Faire tremper les lames de verre dans une solution de substrat de peroxydase composée de 30 mL de Tris-HCl de 50 mM, de pH 7,5 contenant une microspatule pleine de tétrahydrichlorure de 3,3'-diaminobenzidine (DAB) et de 0,002 % (v/v) de H₂O₂ pendant 30 s.
10. Répétez l’étape ci-dessus jusqu’à ce que les cellules apoptotiques soient colorées en brun. Faites tremper les lames de verre dans l’eau pour arrêter la réaction de la peroxydase.
11. Enfermez les cellules avec de l’eau pour l’observation.

3. Mesurer le niveau de phagocytose des cellules apoptotiques

1. Observer les échantillons au microscope optique afin d’évaluer le niveau de phagocytose. Comptez les cellules croquemorto-positives ou les cellules GFP-positives comme des hémocytes, les cellules TUNEL-positives comme cellules apoptotiques et les cellules doublement positives comme des hémocytes phagocytaires.
2. L’indice phagocytaire est défini comme le nombre de cellules doublement positives par rapport au nombre total de cellules Croquemort-positives ou de cellules GFP positives. Il est recommandé d’observer plus de 300 hémocytes.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
sérum de porc entier	MP Biomédical	Référence 55993	Pour le blocage
Kpl Anti-Rat IgG (H+L) Ab MSA, AP	KPL	Tél. : 475-1612	anticorps secondaire pour les hémocytes de coloration avec un anticorps anti-Croquemort
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate	Roche	11383221001	BCIP, Pour la coloration des hémocytes
Bleu nitro tétrazolium	Roche	11383213001	NBT, pour la coloration des hémocytes
Anticorps anti-Croquemort			décrit précédemment dans Manaka et al, J. Biol. Chem., 279, 48466-48476
Apop Tag Peroxydase Kit de Détection Situ de l’Apoptose	Millipore	S7100	Pour la coloration des cellules apoptoitc. Ce kit comprend un tampon d’équilibration, un tampon de réaction, un tampon STOP/Wash, l’enzyme TdT et l’anti-digoxigénine-peroxydase.
tétrahydrichlorure de 3,3'-diaminobenzidine	Nacalai tesque	Référence 11009-41	DAB, pour la coloration des cellules apoptoitc