Dosage de l’efférocytose à cellules fixes : méthode d’étude de l’absorption efférocytaire des cellules apoptotiques par les macrophages à l’aide de la microscopie à fluorescence

Résumé

Source : Taruc, K., et al. Quantification de l’efférocytose par microscopie à fluorescence unicellulaire. J. Vis. Exp. (2018).

Dans cette vidéo, nous démontrons le test d’efférocytose pour étudier la clairance des cellules apoptotiques à l’aide de la microscopie confocale. L’efférocytose est un processus en plusieurs étapes où les cellules apoptotiques sont englouties par des phagocytes et dégradées dans des vésicules appelées efférosomes. Ce protocole fournit une méthode pour visualiser les parties internalisées et non internalisées des cellules apoptotiques individuelles et quantifier l’efférocytose.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local.

1. Culture et préparation de la lignée cellulaire monocytaire THP-1

1. Culture de monocytes de THP-1 en suspension dans des flacons T25 à 37 °C + 5 % de CO₂. Les cellules doivent être cultivées dans 5 mL de Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) + 10 % de sérum de veau fœtal (FBS).
2. Chaque jour, suspendez les cellules uniformément dans tout le milieu de croissance en secouant doucement le ballon, puis comptez immédiatement les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Les cellules doivent être évacuées une fois que la densité cellulaire atteint 1 x 10⁶ cellules/mL :
   1. Préchauffage RPMI 1640 + 10 % FBS dans un bain-marie à 37 °C.
   2. Transvasez 2 x 10 5 cellules dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL ou un tube conique de 15 mL, et les cellules à granulés par centrifugation à 500 x g à température ambiante pendant 5 min.
   3. Retirer le surnageant sans perturber la pastille cellulaire et remettre la pastille en suspension dans 1 mL (tube de microcentrifugation de 1,5 mL) ou 5 mL (tube conique de 15 mL) de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
   4. Centrifugez le tube à 500 x g à température ambiante pendant 5 min. Retirez le PBS sans déranger la pastille de cellule.
   5. Remettre la pastille en suspension dans 1 mL de RPMI 1640 frais + 10 % FBS.
   6. Dans une nouvelle fiole T25, placez 4 mL de milieu chauffé, et ajoutez-y les cellules remises en suspension de 1.2.5. Cultiver dans un incubateur à 37 °C + 5 % de CO₂ jusqu’à ce que les cellules nécessitent un passage (généralement 3 jours), ou jusqu’à ce que des cellules soient nécessaires pour une expérience.
3. Pour une expérience avec des macrophages dérivés de THP-1, prélever le nombre requis de cellules du ballon et de la plaque avant de passer :
   1. Placez le nombre requis de lamelles de verre circulaires de 18 mm (épaisseur #1,5) dans les puits d’une plaque de 12 puits - généralement 1 lamelle par condition et/ou point temporel. Dans chaque puits, aliquote 5 x 10⁴ monocytes THP-1. Le nombre de cellules ajoutées à chaque puits peut être modifié si nécessaire.
   2. Augmenter le volume total de chaque puits contenant des cellules à 1 mL à l’aide d’un RPMI + 10 % FBS chauffé à 37 °C.
   3. Ajouter 100 nM de phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) dans chaque puits et cultiver pendant 3 jours pour induire la différenciation des monocytes de THP-1 en cellules de type macrophage.

2. Culture et préparation de la lignée cellulaire de macrophages J774.2

1. Cultiver des cellules J774.2 dans des flacons T25 à 37 °C + 5 % de CO₂. Les cellules doivent être cultivées dans 5 mL de milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) + 10 % de FBS et passées une fois que la culture atteint 80-90 % de confluence. Vers les cellules de passage :
   1. Retirer tous les milieux de la fiole et lever une fois avec 5 mL de PBS.
   2. Retirer le PBS de la fiole et le remplacer par 5 ml de DMEM frais + 10 % de FBS.
   3. À l’aide d’un grattoir à cellules, racler le fond de la fiole pour suspendre les cellules dans le milieu. Pipetez vigoureusement les cellules plusieurs fois pour briser les agrégats cellulaires.
   4. Diluer les cellules 1:5 en retirant 4 mL de la suspension cellulaire du ballon et en la remplaçant par 4 mL de milieu frais. La suspension cellulaire restante peut être jetée, utilisée pour démarrer une nouvelle culture cellulaire dans une nouvelle fiole T25, ou utilisée pour une expérience.
2. Pour préparer un test d’efférocytose à l’aide de cellules J774.2 :
   1. Un jour avant le début de l’expérience, suspendre les cellules J774.2 dans 5 mL de milieu frais, conformément aux étapes 1.1.1 à 1.1.3. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et préparer le volume nécessaire de cellules à une concentration de 5 x 10⁴ cellules/mL.
   2. Placez le nombre nécessaire de lamelles de verre circulaires de 18 mm (épaisseur #1,5) dans les puits d’une plaque à 12 puits. Dans chaque puits, aliquote 1 mL de la suspension de 5 x 10⁴ cellules/mL.
   3. Cultiver pendant la nuit pour permettre aux cellules d’adhérer à la lamelle et de se remettre du passage.

3. Culture de macrophages M2 humains primaires

1. Prélever 10 ml de sang humain hépariné pour chaque plaque de 12 puits de macrophages M2 requise.
2. Dans un tube à centrifuger de 15 ml, superposez 5 ml de sang humain sur 5 ml de milieu de séparation cellulaire Lympholyte-poly préchauffé. Préparez plusieurs tubes si vous traitez >5 ml de sang plutôt que d’utiliser des tubes de plus grand volume.
3. Centrifugeuse à 300 x g pendant 35 min, en utilisant une accélération moyenne et sans pause.
4. Retirez délicatement la bande supérieure riche en cellules mononucléaires à l’aide d’une pipette en plastique et transférez-la dans un tube à centrifuger de 50 ml. Si plusieurs tubes ont été préparés à l’étape 3.2, les bandes peuvent être regroupées en un seul tube de 50 ml. Porter le volume du tube jusqu’à 50 mL avec PBS.
5. Centrifuger à 300 x g pendant 8 min et retirer le surnageant. Au cours de cette étape, placez des lamelles circulaires autoclavées de 18 mm de diamètre (épaisseur #1,5) dans chaque puits d’une plaque à 12 puits.
6. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 300 μL de RPMI 1640 sans sérum par nombre de puits souhaité ; p. ex., si 10 mL de sang ont été traités pour préparer une plaque complète de 12 puits, suspendre la pastille cellulaire dans 3,6 mL de milieu.
7. Ajouter 300 μL de suspension cellulaire dans chaque puits contenant une lamelle dans la plaque à 12 puits. Incuber pendant 1 h à 37 °C + 5 % CO₂.
8. Lavez délicatement la lamelle 3 fois avec 1 ml de PBS réchauffé pour éliminer toutes les cellules non adhérentes.
9. Ajouter 1 mL de RPMI 1640 + 10 % de FBS + 10 ng/mL de M-CSF humain recombinant + antibiotique/antimycosique de culture cellulaire. Incuber à 37 °C + 5 % CO₂ pendant 5 jours.
10. Remplacer le milieu par RPMI 1640 + 10 % FBS + 10 ng/mL de M-CSF humain recombinant + 10 ng/mL d’IL-4 humaine recombinante + antibiotique/antimycosique de culture cellulaire. Incuber à 37 °C + 5 % CO₂ pendant 2 jours pour compléter la polarisation M2.
11. Les macrophages polarisés doivent être utilisés dans les 3 prochains jours.

4. Préparation des cellules Jurkat apoptotiques

1. Cultiver des cellules Jurkat dans 5 mL de RPMI 1640 + 10 % de FBS à 37 °C + 5 % de CO₂. Les Jurkats sont une lignée cellulaire en suspension et peuvent être maintenus en passant 1:5 dans un milieu frais et préchauffé tous les 3 à 5 jours.
2. Pour préparer les cellules apoptotiques, laissez la culture Jurkat croître jusqu’à une densité élevée (4 à 5 jours après le passage). Aliquote 1,5 mL dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et des cellules à granules par centrifugation à 500 x g pendant 5 min.
3. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de milieu RPMI 1640 sans sérum contenant 1 μM de staurosporine.
4. Incuber 16 h à 37 °C + 5 % de CO₂ pour rendre les cellules apoptotiques.
5. Si vous le souhaitez, confirmer l’induction de l’apoptose par coloration à l’Annexine V :
   1. Aliquote 100 μL de culture cellulaire Jurkat traitée à la staurosporine dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL. Centrifuger les cellules à 500 x g pendant 5 min, jeter le surnageant et remettre en suspension les granules cellulaires dans 100 μL de milieu RPMI 1640 sans sérum.
   2. Ajouter 1 μL d’Annexine V conjuguée à l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) et incuber pendant 10 min à température ambiante dans l’obscurité.
   3. Ajouter 900 μL de PBS et transférer tout le volume dans un seul puits d’une plaque de 12 puits contenant une lamelle de verre circulaire de 18 mm (épaisseur #1,5). Faites tourner dans une centrifugeuse équipée d’un adaptateur de plaque à 200 x g pendant 1 min pour forcer les cellules à adhérer à la lamelle. Alternativement, les cellules peuvent être placées dans une lame chambrée pour l’imagerie.
   4. Image à l’aide d’un microscope à fluorescence.

5. Quantification de l’absorption et de la dynamique des efferocytes à l’aide d’un test d’efférocytose à cellules fixes et d’une coloration de l’intérieur vers l’extérieur

1. Préparez les macrophages humains THP-1, J774.2 ou M2 comme décrit dans les sections 1 à 3, respectivement.
2. La veille du début de l’expérience, préparer les cellules apoptotiques Jurkat comme décrit à la section 4.
3. Immédiatement avant l’expérience, comptez les cellules apoptotiques à l’aide d’un hémocytomètre. Transférez un nombre suffisant de cellules apoptotiques dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL – nous ajoutons généralement 5 x 10⁵ cellules/puits, ce qui fournit un rapport cible :efférocytes de 10:1.
4. Granuler les cellules Jurkat par centrifugation à 500 x g pendant 5 min et remettre en suspension dans 500 μL de PBS.
5. Au cours de la centrifugation, aliquote 10 μL de DMSO dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 mL. Dissoudre dans le DMSO une quantité minimale de N-hydroxysuccinimidobiotiotine (NHS-Biotine). 5 à 10 cristaux (~0,005 mg) suffisent.
6. Transférez la suspension de 500 μL de cellules apoptotiques/PBS dans le tube contenant du DMSO/NHS-biotine. Diluez ensuite un colorant de suivi cellulaire à la concentration recommandée par le fabricant dans la suspension cellulaire apoptotique. Assurez-vous de sélectionner un colorant de suivi de cellule qui ne chevauche pas spectralement avec FITC-Streptavidin (par exemple, colorant de suivi de cellules rouges ou rouges lointaines).
7. Incuber la suspension pendant 20 min à température ambiante dans l’obscurité. Ajouter un volume égal de RPMI 1640 + 10 % FBS et incuber pendant 5 min à température ambiante dans l’obscurité pour éteindre tout colorant n’ayant pas réagi.
8. Centrifuger les cellules par centrifugation à 500 x g pendant 5 min, jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules apoptotiques colorées dans 100 μL de RPMI 1640 + 10 % FBS par puits de macrophages.
9. Ajouter 100 μL de suspension de cellules apoptotiques colorées goutte à goutte à chaque puits de macrophages. Centrifugeuse 200 x g pendant 1 min dans une centrifugeuse équipée d’un adaptateur de plaque pour forcer le contact entre les macrophages et les cellules apoptotiques.
10. Incuber la plaque pendant la période de temps souhaitée à 37 °C + 5 % de CO₂ dans un incubateur de culture tissulaire. Pour les macrophages, le matériel efférocytosé est généralement détectable pour la première fois après 20 à 30 minutes et est terminé après 120 à 180 minutes.
11. Au moment souhaité, retirez les cellules de l’incubateur. Lavez les cellules deux fois avec 1 ml de PBS à température ambiante pour arrêter l’efférocytose et éliminer les cellules apoptotiques non efférocytosées.
Ajouter de la
12. streptavidine conjuguée à FITC à une dilution de 1:1 000 dans chaque puits et incuber pendant 20 minutes dans l’obscurité. Cela permettra de marquer la biotine exposée sur tout matériel cellulaire apoptotique non efférocytosé.
    note: Si on le souhaite, les noyaux cellulaires peuvent être colorés au cours de cette étape par l'ajout d'une dilution de 1:20 000 de Hoechst 33342 ou de 4',6-Diamidino-2-Phénylindole, dichlorhydrate (DAPI).
13. Laver les cellules 3 fois avec 1 mL de PBS, en secouant doucement ou en secouant les échantillons pendant 5 minutes par rinçage. Fixez les cellules avec 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dans du PBS pendant 20 min à température ambiante. Rincez les cellules une fois avec du PBS pour éliminer l’excès de PFA.
14. Montage des lamelles sur une lame pour l’imagerie et le transfert vers un microscope à fluorescence. Capturez des empilements z d’un nombre suffisant de cellules pour une quantification précise, généralement de 10 à 30 cellules par condition. Le matériel cellulaire apoptotique non internalisé sera apparent dans l’image résultante sous la forme d’un matériau marqué à un colorant de suivi cellulaire enveloppé par une coloration FITC-streptavidine, tandis que le matériel efférocytosé forme un colorant de suivi cellulaire discret exempt de toute coloration à la streptavidine.
15. Quantifiez l’efférocytose dans les images résultantes via une variété de mesures :
    1. Calculez l’indice efferocytaire en déterminant le nombre moyen d’efférosomes discrets (colorant de suivi cellulaire+/streptavidine-puncta) par macrophage. Quantifier uniquement les macrophages liés à une cellule apoptotique ou contenant ≥1 efférosomes visibles. Enregistrez les macrophages liés à une cellule apoptotique, mais dépourvus d’efférosomes discrets, comme ayant un indice efférocytaire de 0.
    2. Calculez l’efficacité efferocytaire en mesurant la fraction de macrophages contenant ≥1 efférosome.
    3. Calculez le taux d’efférocytose en imageant des cellules fixées et colorées à plusieurs points temporels. N’imagez que les macrophages liés aux cellules apoptotiques, ou contenant des efférosomes visibles, avec des empilements z capturés de chaque cellule. Une fois l’imagerie obtenue, déterminez le taux d’efférocytose :
       1. En utilisant la coloration à la streptavidine comme guide, et l’outil de sélection à main levée ou polygonale dans FIJI/ImageJ (ou un autre logiciel d’analyse d’images), encerclez tout le matériau colorant de suivi cellulaire + / streptavidine (par exemple, internalisé) dans un seul plan de la pile z. Mesurez l’intensité intégrée du colorant de suivi cellulaire dans cette région. Des mesures individuelles pour chaque efférosome (par exemple, le diamètre, le positionnement par rapport au bord de la cellule ou au noyau, etc.) peuvent facilement être acquises en même temps que ces mesures, ce qui augmente considérablement les données collectées lors de l’analyse.
       2. Sur la même section z, en utilisant la coloration à la streptavidine comme guide et l’outil de sélection à main levée ou polygonale, encerclez tout le matériau colorant de suivi de cellule + / streptavidine + (par exemple non internalisé) dans un seul plan de la pile z . N’incluez que la coloration des cellules apoptotiques en contact avec le phagocyte. Mesurer l’intensité intégrée de cette région.
       3. Répétez les étapes 4.2.3.1 à 4.2.3.2 pour les sections z restantes de l’image. Additionner l’intensité intégrée des matériaux efferocytosés (Σ_eff) et non efférocytosés (Σ_ne). La fraction de la cellule apoptotique qui a été efférocytosée peut être calculée pour la cellule comme suit :
          

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Média RPMI 1640	bison d’europe	3500-000-EL
Médias DMEM	bison d’europe	Référence 319-005-CL
Sérum fœtal bovin (FBS)	bison d’europe	N° 080-150
Pbs	bison d’europe	Référence 311-010-CL
lamelles de recouvrement circulaires en verre de 18 mm d’épaisseur #1.5	Sciences de la microscopie électronique	Référence 72290-08	La taille et la forme de la lamelle ne sont pas critiques, mais 18 mm s’insèrent dans les puits d’une plaque standard à 12 puits, ce qui simplifie la culture cellulaire
Staurosporine	Cayman Chemical	Référence 81590	Dissoudre dans le DMSO à 1 mM (solution mère 1 000x)
Annexin V-Alexa 488	ThermoFisher	Réf. R37174
EZ-Link NHS-Biotine	ThermoFisher	20217	Conserver dans un dessicateur. Ne préparez pas de solution mère.
Dmso	Sigma-Aldrich	D2650
CellTrace FarRed	ThermoFisher	Réf. C34572
CellTrace Orange	ThermoFisher	Réf. C34851
Hoescht 33342	ThermoFisher	Référence 62249
FITC-Streptavadin	ThermoFisher	SA1001
Milieu de séparation lympholyte-polycellulaire	Laboratoires Cedarlane	Référence CL5071
M-CSF humain recombinant	Peprotech	Référence 200-04
IL-4 humaine recombinante	Peprotech	300-25
J774.2 Lignée cellulaire de macrophage	Sigma-Aldrich	Référence 85011428-1VL
Lignée cellulaire de monocytes humains THP-1	ATCC	TIB-202
Lignée de cellules T Jurkat	ATCC	TIB-152