Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation des milieux
- Ajouter tous les composants, comme décrit dans le tableau 1, pour obtenir le milieu de collecte d’ovocytes de base et le milieu de maturation des ovocytes. Pour le milieu de collecte de base, réglez le pH à 7,4. Pour le milieu de collecte et de maturation, ajouter 3 mg/mL d’albumine sérique bovine (BSA) et 1 μM de cilostamide le jour de l’utilisation.
2. Préparation de l'encodage de l'ARNm pour Ypet-3' UTR et mCherry
- Obtenir les séquences 3' UTR des ARNm d’intérêt.
note: Pour cette étude, des séquences ont déjà été obtenues à partir d’ADNc d’ovocytes de souris.
- Concevez des amorces pour amplifier les UTR 3' cibles de l'ADNc de l'ovocyte et des parties du vecteur pcDNA 3.1 contenant une séquence codante Ypet, une étiquette d'épitope V5 et un promoteur T7.
- Amplifiez à l’aide d’un kit d’ADN polymérase haute fidélité. Exécutez les produits d'amplification en chaîne par polymérase (PCR) sur un gel pour vérifier si les fragments ont la bonne taille, découpez les bandes et extrayez l'ADN du gel à l'aide d'un kit d'extraction de gel selon les instructions du fabricant.
- Fusionner les fragments de PCR en un vecteur à l’aide d’un kit de clonage PCR.
note: Les fragments de PCR ont été incubés sur de la glace pendant 4 h pour faciliter un processus de recombinaison plus efficace. Ceci est contraire aux instructions du fabricant, qui préconise un temps d'incubation de seulement 45 min.
- Transfectez des fragments de PCR dans des bactéries Escherichia coli 5-α compétentes.
- Ajouter le mélange et le plasmide aux bactéries et incuber sur glace pendant 30 min.
- Choquez thermiquement le mélange et le plasmide en plaçant le mélange dans un bain-marie à 42 °C pendant 45 s, et laissez refroidir immédiatement sur de la glace pendant 3 min.
- Ajouter 500 μL de bouillon Super Optimal avec milieu de répression catabolite (SOC) et incuber pendant 1 h à 37 °C.
- Essorez à 7000 × g pendant 2 min et retirez la majeure partie du surnageant. Remettre en suspension et déposer sur une plaque de gélose Luria Broth (LB) avec l’antibiotique de sélection approprié.
note: La carbenicilline a été utilisée dans cette étude.
- Incuber toute la nuit à 37 °C. Isolez les colonies en appuyant légèrement la pointe d’une pipette sur l’une des colonies et en la plaçant dans 3 mL de milieu LB avec 100 μg/mL de carbénicline. Incuber pendant 12 à 24 h à 37 °C.
- Extrayez l'ADN des plasmides à l'aide du kit d'isolement de l'ADN plasmidique selon les instructions du fabricant et confirmez les séquences via le séquençage de l'ADN.
- Pour Ypet/3' UTR :
- Produire un modèle PCR linéaire pour la transcription in vitro. Utilisez une amorce en amont de la séquence Ypet et une amorce inverse avec 20 résidus de thymine supplémentaires. Voir le Tableau 2 pour la séquence de Ypet/IL-7 3' UTR et les séquences des amorces avant et arrière.
note: Ces résidus de thymine supplémentaires ajouteront des oligo(A) à l’ARNm linéaire après transcription in vitro.
- Transcrire in vitro le produit PCR à l'aide d'un kit de transcription T7 selon les instructions du fabricant.
- Purifiez l'ARN complémentaire (ARNc) résultant à l'aide d'un kit de nettoyage de transcription selon les instructions du fabricant.
- Éluer l’ARNc purifié dans de l’eau exempte d’ARNA, mesurer la concentration et évaluer l’intégrité par électrophorèse de l’agarose. Conserver à −80 °C.
- Pour mCherry :
- Produisez un modèle de PCR linéaire pour la transcription in vitro en utilisant une enzyme de restriction haute fidélité ; utilisez l’enzyme de restriction mfEI-HF si vous répliquez cet exemple. Digérer dans un tampon de digestion pendant la nuit à 37 °C.
- Faites fonctionner un gel pour purifier l'échantillon et extrayez l'ADN linéaire à l'aide d'un kit d'extraction de gel selon les instructions du fabricant.
- Transcrire in vitro le produit PCR à l'aide d'un kit de transcription T7 selon les instructions du fabricant.
- Polyadényler l'ARNc (150-200 nucléotides) à l'aide d'un kit de résidus poly(A) selon les instructions du fabricant.
- Purifiez l'ARNc résultant à l'aide d'un kit de nettoyage de transcription selon les instructions du fabricant.
- Éluer l’ARNc purifié dans de l’eau exempte d’ARNm, mesurer les concentrations d’ARNm et évaluer l’intégrité du message par électrophorèse sur gel. Conserver à −80 °C.
3. Procédure expérimentale
REMARQUE : La figure 1 donne un aperçu schématique de la micro-injection d’ovocytes et de la microscopie à intervalle de temps qui s’ensuit.
- Jour 1
- Injecter par voie intrapéritonéale à des souris de 21 jours 5 UI de gonadotrophine sérique de jument gestante pour favoriser la croissance des follicules jusqu'au stade antral.
- Jour 3
- Prélèvement d’ovocytes
- Ouvrez soigneusement les follicules antraux en faisant une petite incision dans la paroi du follicule avec une aiguille de 26 G. Isolez des ovocytes entiers contenant des cumulus contenant plusieurs couches de cellules cumulus à l’aide d’une pipette en verre à commande buccale.
- Utilisez une pipette plus petite (légèrement plus grande que le diamètre de l’ovocyte) et dénudez mécaniquement les COC par pipetage répété.
note: Vous pouvez également effectuer une micro-injection sur des COC intacts.
- À l’aide d’une pipette plus grande, aspirez les ovocytes dénudés et placez-les dans une boîte de Pétri avec un milieu de maturation complété par 1 μM de l’inhibiteur de la phosphodiestérase, le cilostamide, pour empêcher la reprise de la maturation méiotique. Placez la boîte dans l’incubateur pendant 2 h pour permettre aux ovocytes de récupérer du stress induit par l’isolement des ovocytes des follicules.
- Micro-injection d’ovocytes
- Préparez les aiguilles d’injection en plaçant un tube capillaire en verre borosilicaté de 10 cm de long dans un extracteur mécanique. Pour une injection optimale, pliez la pointe de l’aiguille à 45° à l’aide d’un filament chauffé.
- Préparez des boîtes en polystyrène avec 20 gouttelettes de 20 μL de milieu de collecte d’ovocytes de base et recouvrez les gouttelettes d’huile minérale légère.
- Préparez un mélange rapporteur en ajoutant 12,5 μg/μL d'Ypet-3' UTR et 12,5 μg/μL de mCherry. Préparez un volume plus important et faites des aliquotes pour les expériences futures afin d’assurer des concentrations similaires de rapporteurs. Stockez ces aliquotes à -80 °C. Après décongélation, centrifugez d’abord l’aliquote pendant 2 min à 20 000 x g et transférez-la dans un nouveau tube de microcentrifugation.
note: Cette centrifugation empêchera l’aiguille d’injection d’être obstruée par des agrégats potentiels dans le mélange rapporteur.
- Chargez l’aiguille d’injection par capillarité avec environ 0,5 μL de mélange rapporteur.
- Placez la pipette de maintien et l’aiguille d’injection chargée dans les supports, puis positionnez-les dans la gouttelette du milieu de collecte des ovocytes. Aspirez une partie du fluide dans la pipette de maintien.
- Ouvrez l’aiguille d’injection en la tapotant doucement contre la pipette de maintien.
- Placez les ovocytes dans une gouttelette de milieu de collecte de base et injectez 5 à 10 pL du mélange rapporteur
.
- Incuber les ovocytes dans le milieu de maturation avec 1 μM de cilostamide pendant 16 h pour permettre au signal mCherry de plafonner.
- Préparez une boîte de Pétri qui sera utilisée pour la microscopie à intervalle de temps avec au moins deux gouttelettes de 20 μL de milieu de maturation pour chaque rapporteur injecté : une gouttelette avec 1 μM de cilostamide pour les ovocytes témoins arrêtés par la prophase I et une gouttelette sans cilostamide pour les ovocytes en maturation. Couvrez les gouttelettes d’huile minérale légère et placez-les dans l’incubateur.
- Microscopie time-lapse
- Après la pré-incubation, retirez les ovocytes injectés de l’incubateur et lavez-les quatre fois dans un milieu de maturation sans cilostamide. Conservez certains ovocytes dans un milieu de maturation avec du cilostamide de 1 μM comme groupe témoin d’ovocytes arrêtés par la prophase I.
- Transférez les ovocytes injectés dans leurs gouttelettes respectives sur la boîte de microscope time-lapse préalablement préparée. Regroupez les ovocytes à l’aide d’une pipette en verre fermée (une pipette fermée peut être préparée en tenant l’embout dans une flamme pendant quelques secondes).
note: Le regroupement des ovocytes permet d’empêcher leur mouvement pendant l’enregistrement.
- Placez la parabole sous le microscope équipé d’un système d’éclairage à diodes électroluminescentes et d’une platine motorisée équipée d’une chambre environnementale maintenue à 37 °C et 5 % CO2. Pour reproduire cette étude, utilisez les paramètres suivants : jeu de filtres : miroir dichroïque YFP/CFP/mCherry 69008BS ; Canal YFP (Excitation (Ex) : S500/20 × 49057 ; Émission (EM) : D535/30 m 47281), canal mCherry (Ex : 580/25 × 49829 ; Ém : 632/60 m).
- Entrez les paramètres appropriés pour l’expérience time-lapse (voir la table des matériaux pour le logiciel utilisé dans cette étude) : Cliquez sur Applications | Acquisition multidimensionnelle. Sélectionnez le premier onglet Principal et sélectionnez timelapse, plusieurs positions de scène et plusieurs longueurs d’onde.
- Sélectionnez l’onglet Enregistrement pour saisir l’emplacement où l’expérience doit être enregistrée.
- Sélectionnez l’onglet Timelapse pour saisir le nombre de points temporels, la durée et l’intervalle de temps.
note: La durée de l’expérience en accéléré dépend de l’espèce animale étudiée, car le moment de la maturation méiotique des ovocytes diffère d’une espèce à l’autre. Dans cette expérience avec des ovocytes de souris, les ovocytes ont été enregistrés toutes les 15 minutes pendant 16 heures.
- Sélectionnez l’onglet Étape. Activez le fond clair et localisez la position des ovocytes en ouvrant une nouvelle fenêtre en sélectionnant Acquérir | Acquérir | Spectacle en direct. Une fois les ovocytes localisés, revenez à la fenêtre d’acquisition multidimensionnelle et appuyez sur + pour définir l’emplacement des ovocytes.
- Sélectionnez l'onglet Longueurs d'onde et définissez 3 longueurs d'onde différentes pour le fond clair (exposition 15 ms), YFP (exposition 150 ms pour Ypet/IL7 3' UTR) et mCherry (exposition 75 ms pour Ypet/IL7 3' UTR).
note: Ajustez l'exposition de chaque rapporteur Ypet/3' UTR en fonction du niveau d'accumulation de rapporteur et du volume injecté. S’assurer que le signal YFP se situe au centre de la plage de détection au début de l’expérience pour éviter la sous-estimation ou la saturation en cas d’activation de la traduction. Pour mCherry, ajustez l’exposition pour chaque lot de mCherry car le signal dépend du nombre de nucléotides d’adénine ajoutés pendant la procédure de polyadénylation. En raison de la variation de l’efficacité de la polyadénylation, utilisez le même lot de mCherry dans différentes expériences pour une meilleure comparaison entre les expériences.
- Lancez l’expérience time-lapse en cliquant sur Acquérir. Voir la figure 1 pour un exemple d’enregistrement en accéléré dans un seul ovocyte.
- Analyse de la traduction UTR d'Ypet-3'
- Pour cette analyse (voir la table des matériaux pour le logiciel utilisé dans cette étude), effectuez deux mesures de région pour chaque ovocyte : l’ovocyte lui-même - cliquez sur la région de l’ellipse et entourez l’ovocyte - et une petite région proche de l’ovocyte à utiliser pour la soustraction de l’arrière-plan - cliquez sur la région rectangulaire.
note: Assurez-vous que les ovocytes ne sortent pas de la région sélectionnée pendant l’enregistrement en accéléré. Portez une attention particulière à l’emplacement de la mesure de la région autour de l’extrusion du corps polaire, car cela provoque un mouvement dans l’ovocyte et peut fausser l’enregistrement.
- Exportez les données de mesure de la région vers une feuille de calcul en cliquant d’abord sur Ouvrir le journal, puis sur Données du journal pour exporter le logiciel d’analyse des données.
- Pour chaque ovocyte individuel et pour tous les points temporels mesurés, soustrayez la mesure de la région d’arrière-plan de la mesure de la région de l’ovocyte. Procédez séparément pour les longueurs d’onde YFP et mCherry.
Tableau 1 : Préparation des milieux. Liste des composants qui doivent être ajoutés pour préparer le milieu de collecte d’ovocytes de base et le milieu de maturation des ovocytes.
| Milieu de prélèvement d’ovocytes de base | |
| composant | Pour 500 mL |
| HEPES modifié Minimum Essential Medium Eagle | 7,1 grammes |
| Bicarbonate de sodium | 252 mg |
| Pyruvate de sodium | 1,15 mL |
| Pénicilline/Streptomycine 100x | 5 mL |
| Eau distillée ultra-pure (Invitrogen, 10977-015) | Jusqu’à 500 mL |
| Milieu de maturation | |
| composant | Pour 500 mL |
| MEM alpha 1x | Jusqu’à 500 mL |
| Pyruvate de sodium | 1,15 mL |
| Pénicilline/Streptomycine 100x | 5 mL |
Tableau 2 : Exemple de séquences de rapporteur et d'amorce Séquence de rapporteur YFP/IL7 3'UTR et séquences d'amorces directes et inverses qui ont été utilisées pour produire un modèle de PCR linéaire pour la transcription in vitro.
| séquence |
| Ypet/Interleukin-7 3' UTR | GAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACCGGGGTCGCCACCATGGTGAGCAAAGGCGAAGAGCTGTTCACC
GGCGTGGTGGTGCCCATCCTGGGAGCTGGACGGCGACGTGAACGGCCACAAGTTCAGCGTGAGCGGCGAGGGCGAGGGCGACGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGCTGCTGTGCACCACCGGCAAGCTG
CCCGTGCCCTGGGGCCCCCTGGTGACCACCGGGGCGTGCAGTGCTTCGCCCGGTACCCCGACCGACCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGAGCGCCATGCGCGAGGGAGGCgaggac
TCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGGGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGGATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACA
TACAACTACAACAGCCAACGTGTACACCGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGCAAGCAAGCAAGCAACTTCAGATCCGGCAACAACATCGAGGACGGCGGCGTGCAGCTGGCCGACTACCAGCAGAACACCCCCA
TCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCTACCAGAGCGCCCTGTTCAAGGACCCCAACGAGAAGCGGGACCACATGGTGCTGCTGGAGTTCCTGACCGCCGCCGGCATCACCGAGGGC
ATGAACGAGCTCTATAAGAGATCTTTCGAAGGTAAGCCTATCCCTAACCCTCTCCTCGGTCGATTCTACGCGTACCGGTCATCATCACCATCACCATTGAACAGGACATGTAGTAACAACCTCCAAGAATCTACTGGTT
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ACCTTAGTATTCAGTCGCTTTTGACACTTGTATAAAGCTTATATAACTGAATTTTCAATTTGAAAAGTATATTTTTAAAATAATATATGCTAGACTTTTAATTAATGTATGTTTAATTTTGGCATTCTGTCTGTCTCT
CTGTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTTATTATATATATATAATTTTACTAATTACTAATTCGTGTCTTTTTTTTTTCGAGAG
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CTGCTGTCTTCCTTCAGTTGTAATGGAAAGAAACACTATGTTGTAGAGGCCAAATTTCTGAAAGTGATAAGGGTTTGCTTGTACTGAATTCTCTCCTTGCTTTTTCCAGCCACGTGAGCATCTAGCTATCTATACGCT
GGATGTATTTGACCGATGCCTGCTCCACTGGCACATTGCATGTGTGGTAGCCATGCCTTCTTGCTTCTCCTTCTCCTTCCCCAACCCCTAATGCTCTACTCAGTGGTACAGATAGCTGGGATTATCACAATTTTGAGAGAAAC
ACCAATTGTTTAAAGTTTGTTTCATAATCACCATTTGCCCAGAACAGTTCTCTCAACTTGTTTGCAACATGTAATAATTTAAGAAACTTAATTGTTAATGGACTTTCGATAACTTCCTTAGATCCCACATCTCCTACGT
GTCAGTCCTTTGTCCTGAGGAACTGGTAAAATGGGTAAGCCCTTAGCGAACTGAAGGCATTCGCATGTGTAAGATAATCTCTATACCTGCAAGGCTGTGTGTGGATGGCTCCCTACCAATATTGAACAATATTCTGATT
TTGGCAAAATAATAGATATATTTT |
| Apprêt avant | GAGAACCCACTGCTTAC |
| Amorce inversée | TTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAAATATTATCCTTTATTTTGCCAAAATC |
