Dosage de l’absorption du calcium mitochondrial : méthode basée sur un lecteur de plaque pour mesurer l’absorption du calcium dans des mitochondries isolées

Abstract

Source : Maxwell, J.T., et al., Analyses de l’afflux de calcium mitochondrial dans les mitochondries isolées et les cellules cultivées. J. Vis. Exp. (2018).

Cette vidéo décrit un test basé sur un lecteur de plaque pour mesurer l’absorption de calcium mitochondrial dans des mitochondries isolées. Le test analyse le signal de fluorescence d’un colorant fluorescent sensible au calcium pour étudier la cinétique de l’absorption mitochondriale du calcium et de la surcharge calcique.

Protocol

1. Réactifs et solutions

1. Préparez 500 mL de tampon MS-EGTA pour l'isolement mitochondrial : 225 mM de mannitol, 75 mM de saccharose, 5 mM d'acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinéthanesulfonique (HEPES), 1 mM d'éthylène glycol-bis(β-aminoéthyl éther)-N,N,N',N'-acide tétraacétique (EGTA), pH ajusté à 7,4 avec KOH. Stérilisez-le à l’aide d’un filtre de 0,22 μm et conservez-le à 4 °C. Assurez-vous que le tampon MS-EGTA est pré-refroidi à 4 °C avant utilisation.
2. Préparez 100 mL de tampon KCl : 125 mM KCl, 20 mM HEPES, 1 mM KH₂PO₄, 2 mM MgCl₂, 40 μM EGTA et pH ajusté à 7,2 avec KOH. Conservez-le à température ambiante.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Synergy Neo2 Lecteur de microplaques multimode avec injecteurs	Biotek
Homogénéisateur de tissus	Kimble	Référence 886000-0022
Plaque à 96 puits	Corning	Référence 3628
Vert Calcium-5N	Invitrogen	Réf. C3737
Dmso	Invitrogen	D12345
HEPES	sigma	N° H3375
EGTA	sigma	E8145
chlorure de potassium	pêcheur	BP366-500
chlorure de magnésium	sigma	M2670
Pyruvate de sodium	sigma	Réf. P2256
Acide L-malique	sigma	M1125
Chlorure de calcium	sigma	Réf. C4901
Phosphate de potassium monobasique	sigma	Réf. P0662