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1. Réactifs et solutions
- Préparez 500 mL de tampon MS-EGTA pour l'isolement mitochondrial : 225 mM de mannitol, 75 mM de saccharose, 5 mM d'acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinéthanesulfonique (HEPES), 1 mM d'éthylène glycol-bis(β-aminoéthyl éther)-N,N,N',N'-acide tétraacétique (EGTA), pH ajusté à 7,4 avec KOH. Stérilisez-le à l’aide d’un filtre de 0,22 μm et conservez-le à 4 °C. Assurez-vous que le tampon MS-EGTA est pré-refroidi à 4 °C avant utilisation.
- Préparez 100 mL de tampon KCl : 125 mM KCl, 20 mM HEPES, 1 mM KH2PO4, 2 mM MgCl2, 40 μM EGTA et pH ajusté à 7,2 avec KOH. Conservez-le à température ambiante.
- Préparez 1 mM de vert de calcium-5N dans du sulfoxyde de diméthyle (DMSO). Le stock de vert de calcium-5N peut être aliquotté et stocké à -20 °C.
- Préparez les substrats pour l’absorption de Ca2+.
- Préparez 1 M de pyruvate de sodium, pH 7,4. Conservez-le dans des aliquotes à -20 °C.
- Préparez 500 mM de malate, pH 7,4. Conservez-le dans des aliquotes à -20 °C.
2. Isolement des mitochondries cardiaques
- Euthanasier la souris selon les normes institutionnelles.
note: Pour notre méthode d’euthanasie approuvée par l’institution, les souris ont été anesthésiées par inhalation d’isofluorane et sacrifiées par luxation cervicale.
- Prélevez le cœur en ouvrant la cavité thoracique, en coupant de chaque côté des côtes, en flanquant le cœur, en coupant le diaphragme et en excisant le tissu cardiaque.
note: Dans ce protocole, l’isolement mitochondrial est effectué à partir d’un cœur entier prélevé sur une souris adulte (environ 120 mg), ce qui devrait être suffisant pour 3-4 expériences. Pour l’isolement mitochondrial d’autres tissus riches en mitochondries tels que le foie, jusqu’à 200 mg de tissu peuvent être utilisés en suivant le protocole décrit.
- Rincez abondamment le tissu dans 25 ml de solution saline glacée 1x tamponnée au phosphate (PBS), en veillant à ce que tout le sang soit expulsé des ventricules.
note: Le cœur sera suffisamment rincé lorsque le liquide expulsé du cœur sera clair.
- Coupez le cœur en petits morceaux dans 5 ml de PBS 1x glacé à l’aide d’une paire de ciseaux bien aiguisés.
- Jeter le PBS et transférer le tissu cardiaque haché dans un homogénéisateur en verre de 7 ml pré-refroidi avec un dégagement de 0,10 à 0,15 mm.
- Ajouter 5 mL de tampon MS-EGTA glacé et homogénéiser l’échantillon jusqu’à ce que les morceaux de tissu ne soient plus visibles (environ 11 coups).
note: Ne pas trop homogénéiser le tissu car le but est d’obtenir des mitochondries intactes et fonctionnelles.
- Transvaser l’homogénat dans un tube de 15 mL.
- Centrifuger l’homogénat à 600 x g à 4 °C pendant 5 min jusqu’à l’obtention de noyaux de granulés et de cellules intactes.
- Transférez le surnageant dans un tube frais de 15 mL et centrifugez-le à 10 000 x g à 4 °C pendant 10 min sur des mitochondries en granulés.
- Jetez le surnageant et conservez la pastille mitochondriale sur de la glace.
- Lavez la pastille mitochondriale deux fois à l’aide d’un tampon MS-EGTA glacé. Pour chaque lavage, remettre la pastille mitochondriale en suspension dans 5 mL de tampon MS-EGTA, la centrifuger à 10 000 x g à 4 °C pendant 10 min et jeter le surnageant.
- Après le lavage final, jetez le surnageant et remettez les mitochondries en suspension dans 100 μL de tampon MS-EGTA glacé. Gardez les mitochondries sur la glace.
note: Les mitochondries doivent être utilisées pour l’expérimentation dans un délai de 1 h.
- Mesurez la concentration en protéines mitochondriales à l’aide d’un test de protéines Bradford.
3. Mesure de l’absorption de calcium mitochondriale à l’aide d’un lecteur de plaques
NOTE : Ici, il est décrit le protocole d’analyse de l’absorption mitochondriale de Ca2+ à l’aide d’un lecteur de plaques multimode équipé d’injecteurs. Tout lecteur de plaques capable de lire la fluorescence du vert de calcium-5N (excitation/émission de 506/532 nm) en mode cinétique avec des injecteurs de réactifs automatisés pour protéger la réaction de la lumière peut être utilisé.
- Programmez le lecteur de plaques pour qu’il effectue une lecture cinétique de la fluorescence du vert de calcium-5N avec des mesures prises toutes les secondes pendant une durée totale de dosage de 1 000 s. De plus, programmez les injecteurs de réactifs pour distribuer 5 μL de solution de CaCl2 aux points de temps de 30 s, 150 s, 300 s, 480 s et 690 s.
note: Le moment des injections de CaCl2 est défini par l’utilisateur et peut être ajusté en fonction des besoins expérimentaux.
- Amorcez les injecteurs de réactifs avec la solution de CaCl2 à utiliser.
note: La concentration de la solution de CaCl2 est définie par l’utilisateur et peut être ajustée lors des cycles suivants pour titrer la quantité de Ca2+ nécessaire pour déclencher l’ouverture du MPTP.
- Ajouter 200 μg de mitochondries dans un puits individuel d’une plaque de 96 puits.
- Ajouter le volume approprié de tampon KCl dans le puits de sorte que le volume total des mitochondries et du tampon KCl s’élève à 197 μL.
- Ajouter 1 μL de pyruvate 1 M et 1 μL de malate 500 mM au mélange de mitochondries. Pipetez doucement pour mélanger, et incubez les mitochondries avec les substrats pendant 2 min à température ambiante pour permettre aux mitochondries de se dynamiser.
- Ajouter 1 μL de 1 mM de bouillon de vert de calcium-5N. Mélanger délicatement par pipetage.
note: Protéger la réaction de la lumière suite à l’ajout du colorant vert de calcium-5N.
- Démarrez le protocole cinétique préprogrammé et surveillez la fluorescence du vert de calcium-5N.