Dosage de l’absorption du calcium mitochondrial : méthode basée sur un lecteur de plaque pour mesurer l’absorption du calcium dans des mitochondries isolées

1. Réactifs et solutions

1. Préparez 500 mL de tampon MS-EGTA pour l'isolement mitochondrial : 225 mM de mannitol, 75 mM de saccharose, 5 mM d'acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinéthanesulfonique (HEPES), 1 mM d'éthylène glycol-bis(β-aminoéthyl éther)-N,N,N',N'-acide tétraacétique (EGTA), pH ajusté à 7,4 avec KOH. Stérilisez-le à l’aide d’un filtre de 0,22 μm et conservez-le à 4 °C. Assurez-vous que le tampon MS-EGTA est pré-refroidi à 4 °C avant utilisation.
2. Préparez 100 mL de tampon KCl : 125 mM KCl, 20 mM HEPES, 1 mM KH₂PO₄, 2 mM MgCl₂, 40 μM EGTA et pH ajusté à 7,2 avec KOH. Conservez-le à température ambiante.
3. Préparez 1 mM de vert de calcium-5N dans du sulfoxyde de diméthyle (DMSO). Le stock de vert de calcium-5N peut être aliquotté et stocké à -20 °C.
4. Préparez les substrats pour l’absorption de Ca²⁺.
   1. Préparez 1 M de pyruvate de sodium, pH 7,4. Conservez-le dans des aliquotes à -20 °C.
   2. Préparez 500 mM de malate, pH 7,4. Conservez-le dans des aliquotes à -20 °C.

2. Isolement des mitochondries cardiaques

1. Euthanasier la souris selon les normes institutionnelles.
   note: Pour notre méthode d’euthanasie approuvée par l’institution, les souris ont été anesthésiées par inhalation d’isofluorane et sacrifiées par luxation cervicale.
2. Prélevez le cœur en ouvrant la cavité thoracique, en coupant de chaque côté des côtes, en flanquant le cœur, en coupant le diaphragme et en excisant le tissu cardiaque.
   note: Dans ce protocole, l’isolement mitochondrial est effectué à partir d’un cœur entier prélevé sur une souris adulte (environ 120 mg), ce qui devrait être suffisant pour 3-4 expériences. Pour l’isolement mitochondrial d’autres tissus riches en mitochondries tels que le foie, jusqu’à 200 mg de tissu peuvent être utilisés en suivant le protocole décrit.
3. Rincez abondamment le tissu dans 25 ml de solution saline glacée 1x tamponnée au phosphate (PBS), en veillant à ce que tout le sang soit expulsé des ventricules.
   note: Le cœur sera suffisamment rincé lorsque le liquide expulsé du cœur sera clair.
4. Coupez le cœur en petits morceaux dans 5 ml de PBS 1x glacé à l’aide d’une paire de ciseaux bien aiguisés.
5. Jeter le PBS et transférer le tissu cardiaque haché dans un homogénéisateur en verre de 7 ml pré-refroidi avec un dégagement de 0,10 à 0,15 mm.
6. Ajouter 5 mL de tampon MS-EGTA glacé et homogénéiser l’échantillon jusqu’à ce que les morceaux de tissu ne soient plus visibles (environ 11 coups).
   note: Ne pas trop homogénéiser le tissu car le but est d’obtenir des mitochondries intactes et fonctionnelles.
7. Transvaser l’homogénat dans un tube de 15 mL.
8. Centrifuger l’homogénat à 600 x g à 4 °C pendant 5 min jusqu’à l’obtention de noyaux de granulés et de cellules intactes.
9. Transférez le surnageant dans un tube frais de 15 mL et centrifugez-le à 10 000 x g à 4 °C pendant 10 min sur des mitochondries en granulés.
10. Jetez le surnageant et conservez la pastille mitochondriale sur de la glace.
11. Lavez la pastille mitochondriale deux fois à l’aide d’un tampon MS-EGTA glacé. Pour chaque lavage, remettre la pastille mitochondriale en suspension dans 5 mL de tampon MS-EGTA, la centrifuger à 10 000 x g à 4 °C pendant 10 min et jeter le surnageant.
12. Après le lavage final, jetez le surnageant et remettez les mitochondries en suspension dans 100 μL de tampon MS-EGTA glacé. Gardez les mitochondries sur la glace.
    note: Les mitochondries doivent être utilisées pour l’expérimentation dans un délai de 1 h.
13. Mesurez la concentration en protéines mitochondriales à l’aide d’un test de protéines Bradford.

3. Mesure de l’absorption de calcium mitochondriale à l’aide d’un lecteur de plaques

NOTE : Ici, il est décrit le protocole d’analyse de l’absorption mitochondriale de Ca²⁺ à l’aide d’un lecteur de plaques multimode équipé d’injecteurs. Tout lecteur de plaques capable de lire la fluorescence du vert de calcium-5N (excitation/émission de 506/532 nm) en mode cinétique avec des injecteurs de réactifs automatisés pour protéger la réaction de la lumière peut être utilisé.

1. Programmez le lecteur de plaques pour qu’il effectue une lecture cinétique de la fluorescence du vert de calcium-5N avec des mesures prises toutes les secondes pendant une durée totale de dosage de 1 000 s. De plus, programmez les injecteurs de réactifs pour distribuer 5 μL de solution de CaCl₂ aux points de temps de 30 s, 150 s, 300 s, 480 s et 690 s.
   note: Le moment des injections de CaCl₂ est défini par l’utilisateur et peut être ajusté en fonction des besoins expérimentaux.
2. Amorcez les injecteurs de réactifs avec la solution de CaCl₂ à utiliser.
   note: La concentration de la solution de CaCl₂ est définie par l’utilisateur et peut être ajustée lors des cycles suivants pour titrer la quantité de Ca²⁺ nécessaire pour déclencher l’ouverture du MPTP.
3. Ajouter 200 μg de mitochondries dans un puits individuel d’une plaque de 96 puits.
4. Ajouter le volume approprié de tampon KCl dans le puits de sorte que le volume total des mitochondries et du tampon KCl s’élève à 197 μL.
5. Ajouter 1 μL de pyruvate 1 M et 1 μL de malate 500 mM au mélange de mitochondries. Pipetez doucement pour mélanger, et incubez les mitochondries avec les substrats pendant 2 min à température ambiante pour permettre aux mitochondries de se dynamiser.
6. Ajouter 1 μL de 1 mM de bouillon de vert de calcium-5N. Mélanger délicatement par pipetage.
   note: Protéger la réaction de la lumière suite à l’ajout du colorant vert de calcium-5N.
7. Démarrez le protocole cinétique préprogrammé et surveillez la fluorescence du vert de calcium-5N.