1. Préparation des grandes vésicules unilamellaires (LUV)
- Préparez les LUV pour leur utilisation en tant qu’imitations de membranes cellulaires pour le test de fuite de fluorescence.
- Mélanger avec une seringue en verre Hamilton la phosphatidylcholine (DOPC, 786,11 g/mol), la sphingomyéline (SM, 760,22 g/mol) et le cholestérol (Chol, 386,65 g/mol) au rapport molaire 4:4:2. La solution lipidique est obtenue à partir d’une solution mère de chaque lipide solubilisé dans un solvant méthanol/chloroforme (3/1 ; volume/volume) à 25 mg/mL dans une fiole en verre à fond rond de 25 mL. Sur la base de 4 μmol de DOPC, 4 μmol de SM et 2 μmol de Chol, la solution lipidique est obtenue à partir d’une solution mère en mélangeant 126 μL, 117 μL et 31 μL, respectivement.
prudence: Le méthanol est un solvant toxique et inflammable et le chloroforme est toxique et cancérigène. Les deux doivent être manipulés avec la protection appropriée sous une cagoule.
- Évaporer le méthanol/chloroforme à l’aide d’un évaporateur rotatif sous vide pendant 45 à 60 min à 60 °C jusqu’à la formation d’un film lipidique séché.
- Préparez deux solutions mères tampons HEPES. Préparez le tampon HEPES 1 en mélangeant 20 mM d’HEPES (238,3 g/mol) et 75 mM de NaCl (58,44 g/mol) et ajustez le pH à 7,4. Préparez le tampon HEPES 2 en mélangeant 20 mM d’HEPES et 145 mM de NaCl et ajustez le pH à 7,4. Les tampons HEPES peuvent être conservés à 4 °C pendant 1 mois.
note: Il est recommandé de vérifier l’osmolarité des tampons à l’aide d’un osmomètre.
- Préparer la solution d’hydratation lipidique en dissolvant le couple colorant fluorescent imperméable à membrane, l’acide 8-aminonaphtalène-1, 3, 6-trisulfonique, le sel disodique à 12,5 mM (ANTS, 427,33 g/mol) et le bromure de p-xylène-bispyridinium à 45 mM (DPX, 422,16 g/mol) dans une solution tampon HEPES. Le mélange d’ANTS avec du DPX permet d’obtenir une solution de couleur jaune. Pour atteindre les concentrations de 12,5 mM d’ANTS et de 45 mM de DPX, dissoudre 21,4 mg et 76 mg, respectivement, dans 4 mL de tampon HEPES 1,
note: La solution d’hydratation lipidique peut être conservée pendant 2 semaines à 4 °C en enveloppant le tube dans une feuille d’aluminium.
- Reconstituer les vésicules multilamellaires (MLV) en remettant en suspension le film lipidique séché avec 1 mL de solution d’hydratation lipidique et en vortex jusqu’à dissolution du film lipidique séché. Assurez-vous que la solution est complètement solubilisée, car de petits agrégats lipidiques auront un impact négatif sur les étapes précédentes. Vérifiez également la paroi de la fiole en verre à fond rond pour vous assurer qu’il n’y a pas de film lipidique restant.
note: La solution apparaîtra opalescente et jaune clair après la solubilisation.
- Soumettez les vésicules à cinq cycles de gel/dégel pour obtenir des vésicules unilamellaires. Effectuez chaque cycle en mettant la fiole en verre à fond rond pendant 30 s dans de l’azote liquide pour l’étape de congélation, puis en la laissant dans un bain-marie pendant 2 min pour l’étape de décongélation.
note: La température de l’eau du bain doit être supérieure de 5 à 10 °C à la température de fusion des lipides.
- Préparez l’extrudeuse de lipides en insérant deux supports de filtre préalablement humidifiés avec un tampon HEPES dans chaque pièce d’extrudeuse de polytétrafluoroéthylène (PTFE) placée dans la cartouche d’extrudeuse métallique.
- Placez une membrane en polycarbonate humidifié HEPES (pores de 0,1 μm, 25 mm de diamètre) sur le dessus d’un support de filtre.
- Assemblez les deux bidons d’extrudeuse en métal et vissez-les.
- Placez l’extrudeuse assemblée dans le support et introduisez une seringue de 1 mL dans le trou approprié à l’extrémité de chaque pièce d’extrudeuse de polytétrafluoroéthylène. L’extrusion correspond au passage du liquide testé d’une seringue à l’autre à travers la membrane en polycarbonate.
- Testez l’extrudeuse avec 1 mL de tampon HEPES chargé dans l’une des seringues de 1 mL pour vous assurer qu’il n’y a pas de fuites ou de problèmes.
- Remplacez le tampon HEPES de 1 mL par l’échantillon MLV.
- Effectuez l’extrusion en faisant passer l’échantillon MLV d’une seringue à l’autre à travers la membrane en polycarbonate au moins 21 fois pour obtenir des LUV uniformes de même taille.
note: L’extrusion doit être effectuée à une température supérieure à la température de fusion du mélange de lipides.
2. Purification des LUV
- Préparez une purification de colonne pour éliminer l’excès d’ANTS et de DPX non encapsulés.
- Introduire du gel de dextran réticulé (G-50) remis en suspension dans un milieu aqueux avec 0,01 % de NaN3 (65 g/mol) dans une colonne de chromatographie liquide (Luer Lock, sans chemise, 1,0 cm x 20 cm, volume du lit 16 mL) jusqu’à 1 cm sous le haut de la partie incolore de la colonne.
- Ouvrez le robinet et laissez couler le liquide pour déposer le gel de dextran réticulé.
- Laver la colonne en éluant avec 20 mL de tampon HEPES 2 et jeter le débit de sortie de la colonne.
- Fermez le robinet une fois que le volume mort de solvant au-dessus de la colonne est minimisé (<100 μL) mais suffisant pour éviter tout dessèchement du gel de dextran réticulé.
- Placez les LUV fraîchement extrudés (jaunes) sur la colonne et laissez-les entrer dans le gel de dextran réticulé.
- Ajouter en continu le tampon HEPES 2 à la colonne pour effectuer la purification LUV.
- Éluer environ 2 mL de HEPES buffer 2 (ne pas oublier de remplir régulièrement le haut de la colonne pour éviter de dessécher le gel de dextran réticulé) : la solution jaune libre d’ANTS et de DPX migre plus lentement que les liposomes.
- Commencez à recueillir les LUV purifiés dans des tubes (1,5 ml).
- Observez les gouttes d’éluant de la colonne et lorsqu’elles deviennent opalescentes, elles contiennent des liposomes. Changez le tube pour récupérer la fraction contenant LUV.
- Éluer jusqu’à ce que les gouttes ne soient plus opalescentes (~1 mL). Ensuite, éluer 0,5 mL supplémentaire dans une fraction séparée, puis arrêter l’élution.
REMARQUE : Les étalons sont maintenant disponibles dans une large gamme de masses moléculaires, sous forme de kits ou de masses moléculaires individuelles pour étalonner le volume d’élution des VUL.
- Enveloppez les tubes avec les LUV dans une feuille d’aluminium pour éviter le blanchiment du colorant de fluorescence.
- Lavez la colonne avec 20 mL de tampon HEPES 2.
- Les LUV peuvent ensuite être stockés pendant une semaine à 4 °C
REMARQUE : Étant donné que la stabilité des LUV peut dépendre de la concentration et de la composition des LUV, ainsi que de la force ionique, la taille des LUV doit être contrôlée à l’aide d’un instrument de diffusion dynamique de la lumière (DLS) (voir section 4. Caractérisation de la taille et de l’homogénéité des LUV) avant chaque essai.
3. Quantification de la concentration des LUV
- Estimer la concentration de LUV à l’aide d’un kit de quantification des phospholipides, qui permet d’évaluer la concentration en choline. Ce test pourrait être appliqué lorsque les phospholipides contenant de la choline contenant la tête polaire sont importants (>50 % des LUV).
- Préparez le réactif de couleur en dissolvant 18 mg de substrat chromogène dans 3 mL de tampon fourni.
- Chargez une cuvette en polystyrène, de 10 x 10 x 45 mm, avec 3 mL de réactif de couleur.
- Utilisez le réactif de couleur pure comme condition vide (Blank). Ajouter 20 μL d’échantillon LUV (test) ou 20 μL de solution étalon de concentration connue de choline (étalon).
- Bien mélanger et incuber pendant 5 min à 37 °C dans toutes les conditions (Blank, Test et Standard).
- Mesurer l’absorbance (densité optique, DO) de l’échantillon d’essai et de la solution étalon avec la solution à blanc comme contrôle à 600 nm avec un spectrophotomètre.
- Vérifier les valeurs de DO qui permettent d’estimer la concentration lipidique des LUV, C[LUV], en équivalent choline par rapport à l’étalon de concentration connu.
- Effectuez le calcul à l’aide de l’équation suivante :
C[LUV] (mol / l) = (OD Échantillon / OD Standard) x C[Standard] (mol / l)
REMARQUE : Le kit de quantification des phospholipides a fourni une solution étalon de chlorure de choline (139,6 mg/l) à 54 mg/dL correspondant à une concentration molaire de C[étalon] = 3,87 mmol/L. L’échantillon de DO et l’étalon de DO sont les absorbances mesurées à 600 nm pour les solutions LUV et de choline, respectivement.
4. Caractérisation de la taille et de l’homogénéité des LUV
- Effectuer une mesure à l’aide d’un instrument DLS afin de déterminer la taille de la LUV (en nm) et l’indice de polydispersité (PdI).
- Programmez la « procédure standard de fonctionnement » (SOP) appropriée en indiquant la viscosité du solvant/tampon et de la cuvette utilisée.
- Placez 500 μL de la solution LUV dans une cuvette semi-micro en polystyrène.
- Insérez la cuvette semi-micro en polystyrène dans un instrument DLS.
- À température ambiante, mesurer la distribution granulométrique en termes de taille moyenne (moyenne Z) de la distribution des particules et de l’homogénéité (indice de polydispersité, PdI).
- Tous les résultats sont obtenus à partir de deux mesures indépendantes effectuées chacune en trois cycles répétitifs.
REMARQUE : Les valeurs standard pour les LUV seront une taille moyenne de 137 ± 7 nm avec un PdI de 0,149 ± 0,041.
5. Préparation des solutions peptidiques
- Préparez une solution mère du peptide, qui doit être analysée pour le test de fuite.
- Dissoudre la poudre de peptide (pureté de >95 %) dans de l’eau pure (p. ex., 1 mg de peptide dans de l’eau pure de 500 μL).
note: Il est recommandé de diluer les peptides dans de l’eau pure et d’éviter la solubilisation du diméthylsulfoxyde (DMSO), qui pourrait induire des artefacts (p. ex., perméabilisation membranaire).
- Vortex la solution peptidique pendant 5 s.
- Sonicer la solution peptidique dans un bain de sonication d’eau pendant 5 min, puis centrifuger pendant 5 min à 12 225 x g. Prélever le surnageant pour déterminer la concentration.
- Mesurez l’absorbance à 280 nm de trois dilutions peptidiques indépendantes, puis calculez la concentration peptidique à l’aide de son coefficient d’extinction molaire ε (en fonction de la teneur en tryptophane et en tyrosine dans la séquence peptidique) et de la règle de Beer-Lambert.
note: Si le peptide contient du tryptophane et de la tyrosine, le coefficient d’extinction molaire ε est calculé sur la base du tryptophane ε = 5 690 M-1 cm-1 et de la tyrosine ε = 1 280 M-1 cm-1. Si la séquence peptidique ne contient pas de tryptophane ou de tyrosine, d’autres tests colorimétriques peuvent être effectués pour mesurer la concentration (p. ex., BCA ou Bradford).
- Diluer la solution peptidique dans de l’eau pure jusqu’à obtenir une solution finale de 100 μM et la conserver à 4 °C
note: Dans l’eau pure, aucune dégradation peptidique ne se produit pendant le stockage à 4 °C. Cependant, la concentration en peptides doit être mesurée toutes les 2 semaines pour s’assurer qu’il n’y a pas d’évaporation de l’eau.
6. Essai de fuite de fluorescence
- Le test de fuite de fluorescence est mesuré sur un spectrofluorimètre à température ambiante. Les longueurs d’onde d’excitation et d’émission sont fixées à Ex = 360 nm ± 3 nm et Em = 530 nm ± 5 nm, respectivement.
- Diluer les LUV dans 1 mL de tampon HEPES 2 jusqu’à une concentration finale de 100 μM dans une cuvette à fluorescence de quartz. Ajouter un agitateur magnétique pour homogénéiser la solution pendant l’expérience.
- Mesurer les LUV seuls pendant les 100 premières s, entre t = 0 s et t = 99 s afin d’accéder à la fluorescence de fond.
note: Les LUV seuls ont également pu être mesurés pendant toute la durée de l’expérience (15 min) afin d’accéder à la fluorescence de fond et aux fuites potentielles.
- Par la suite, mesurer la fuite sous forme d’augmentation de l’intensité de fluorescence lors de l’ajout d’aliquotes de solution peptidique pendant les 900 prochaines secondes (15 min). Ce protocole est réalisé pour chaque concentration de peptide testée de 0,1 μM à 2,5 μM.
- Enfin, une fluorescence de 100 % a été obtenue en solubilisant les LUV par addition de 1 μL de Triton X-100 (0,1 %, v/v), ce qui a permis d’obtenir une sonde complètement non éteinte entre t = 1 000 s et t = 1 100 s.
7. Quantification de la fuite
- Supprimez les valeurs obtenues après t = 1 090 s afin de conserver le même nombre de points pour chaque condition testée.
- Calculez la fluorescence minimale, Fmin, en faisant la moyenne de 50 points entre t = 0 s et t = 49 s (LUV seuls).
- Calculez la fluorescence maximale, Fmax, en faisant la moyenne de 50 points entre t = 1 041 s et t = 1 090 s (LUV avec Triton X-100).
- Calculez le pourcentage de fuite ( %Leak) à chaque point temporel (t = x), selon l’équation suivante :
%Fuite(t=x) = (F(t=x) - Fmin) / (Fmax - Fmin) x 100
- Calculer la moyenne et l’écart-type des valeurs obtenues avec une préparation LUV différente (n ≥ 2) pour la même condition.
- Tracez le pourcentage de fuite, %Leak(t=x), en fonction du temps (s).
