1. Collecte et traitement des plantes
- Recueillir et traiter des échantillons de plantes
- Après avoir prélevé des échantillons de plantes, congelez rapidement les échantillons en trempant la matière végétale dans de l’azote liquide à l’aide d’une pince et conservez-les à -80 °C. Si les échantillons de plantes prélevés sont trop gros pour être congelés, refroidissez-les rapidement à l’aide de glace sèche et transférez-les dans un congélateur à -80 °C dès que possible. La teneur en macronutriments du matériel végétal peut changer après que les tissus sont séparés de la plante, il est donc important de congeler les échantillons de plantes dès que possible après la collecte.
ATTENTION : L’azote liquide peut provoquer de graves engelures lorsqu’il est en contact avec la peau. Assurez-vous de transporter l’azote liquide dans des contenants approuvés et de porter un EPI approprié lors de sa manipulation, y compris des gants cryogéniques, des lunettes de protection, un écran facial, un tablier et une blouse de laboratoire.
- Lyophilisez le matériel végétal à l’aide d’un lyophilisateur pour vous assurer que les tissus sont métaboliquement inactifs pendant que l’eau est retirée. Sécher jusqu’à ce que la masse de l’échantillon se stabilise pour s’assurer que toute l’eau a été éliminée.
- Une fois les échantillons secs, broyez-les en une poudre fine à l’aide d’un broyeur ou d’un broyeur. Stocker les échantillons dans une armoire de dessiccation jusqu’à l’analyse.
2. Dosage des protéines solubles
- Préparation des échantillons
- Peser des échantillons répétés de chaque tissu, environ 20 mg chacun, dans des tubes de microcentrifugation en polystyrène de 1,5 mL et des tubes d’étiquetage. Ces échantillons seront par la suite qualifiés d’échantillons inconnus. Consigner la masse exacte de chaque échantillon, car cette information sera nécessaire pour calculer le pourcentage de protéines solubles dans chaque échantillon inconnu. Utilisez des tubes de microcentrifugation avec des couvercles verrouillables, car les couvercles non verrouillables peuvent s’ouvrir pendant l’étape de chauffage suivante, entraînant une perte de solution de l’échantillon.
- Solubiliser et isoler des protéines d’échantillons inconnus
- À l’aide d’une micropipette, ajoutez 500 μL de NaOH 0,1 M dans chaque tube. Fermez hermétiquement les couvercles et laissez agir pendant 30 minutes. Préchauffer un bain d’eau chaude à 90 °C.
ATTENTION : L’hydroxyde de sodium est une base forte et peut provoquer des brûlures au contact de la peau. Bien que 0,1 M de NaOH représente une faible concentration, portez des gants de protection pour éviter toute irritation de la peau.
- Placez les tubes dans une grille dans le bain d’eau chaude pendant 15 minutes.
- Tubes à centrifuger à 15 000 x g pendant 10 minutes. Pipetez le liquide surnageant dans de nouveaux tubes de microcentrifugation étiquetés, à l’aide d’une nouvelle pointe de pipette pour chaque échantillon. Ajouter 300 μL de NaOH 0,1 M dans le tube contenant la pastille et centrifuger à nouveau à 15 000 x g pendant 10 minutes. Encore une fois, prélevez le liquide surnageant et combinez-le avec l’autre liquide surnageant du même échantillon. Il s’agit d’un point d’arrêt potentiel, et les échantillons peuvent être stockés à 4 °C pendant la nuit si nécessaire.
- Précipiter les protéines végétales
- Neutraliser le pH de la solution surnageante en ajoutant 11 μL de HCl 5,8 M. Confirmer un pH de ~7 en trempant du papier tournesol dans chaque solution d’échantillon.
ATTENTION : L’acide chlorhydrique est un acide corrosif fort qui peut provoquer des brûlures au contact de la peau (application cutanée ou inhalation). Veuillez porter des gants pour éviter toute irritation de la peau lors de la manipulation du HCl.
- Ajouter 90 μL d’acide trichloracétique (TCA) à 100 % dans chaque tube et incuber les tubes sur de la glace pendant 30 minutes. La précipitation des protéines transformera la solution de claire à opaque. Si cela ne se produit pas après 30 minutes, réfrigérez les tubes pendant 1 heure. Il s’agit d’un point d’arrêt potentiel, et les échantillons peuvent être stockés à 4 °C pendant la nuit si nécessaire.
ATTENTION : L’acide trichloracétique est corrosif. Veuillez porter des gants lors de la manipulation pour éviter tout contact avec la peau et éviter l’inhalation.
- Centrifugez les échantillons à 13 000 x g pendant 10 minutes à 4 °C. Retirez soigneusement le surnageant de TCA en l’aspirant à l’aide d’une conduite de vide fixée à une pointe de micropipette en verre fin (la même pointe peut être utilisée sur plusieurs échantillons). Ne dérangez pas la pastille de protéine en évitant une aspiration lourde et en gardant une distance appropriée entre la pointe de la pipette et la pastille.
- Lavez rapidement les granulés avec 100 μL d’acétone à -20 °C. Cette étape permet d’éliminer tout TCA restant de la pastille, ce qui peut interférer avec le test Bradford ultérieur ; Cependant, l’acétone commencera à dissoudre la pastille de protéine si elle est laissée en contact trop longtemps, donc l’acétone doit être ajoutée puis rapidement extraite de la pastille dans les 5 secondes.
- Laissez l’acétone s’évaporer en plaçant les tubes dans une hotte ou un réfrigérateur. Ensuite, dissolvez la pastille de protéine en ajoutant 1 mL de NaOH 0,1 M dans chaque tube. La dissolution complète de la pastille peut nécessiter plusieurs cycles de chauffage dans un bain d’eau chaude, un vortex et une sonication.
REMARQUE : Plus les tubes restent longtemps dans la hotte ou le réfrigérateur et plus les granulés deviennent secs, plus ils seront difficiles à re-solubiliser. Il est suggéré de sécher la pastille pendant 30 minutes, puis de vérifier la présence d’acétone toutes les 10 à 15 minutes jusqu’à ce qu’il soit clair que l’acétone s’est évaporée (aucune vapeur d’acétone n’est détectable).
- Mélangez des solutions étalons, diluez des solutions d’échantillons inconnus et quantifiez la teneur totale en protéines d’échantillons inconnus à l’aide du test Bradford.
- Préparer des solutions étalons d’immunoglobulines G (IgG) bovines selon les concentrations indiquées au tableau 1 (une solution mère lyophilisée ou IgG peut être mélangée à de l’eau désionisée pour atteindre chaque concentration). Conserver les normes à 4 °C. Dans une plaque à 96 puits, ajouter 160 μL de chaque solution étalon d’IgG en trois exemplaires en commençant par la position A1 de la plaque de puits (0 μg/μL en position A1, A2, A3, 0,0125 μg/μL en positions B1, B2, B3, etc.).
- Préparez une solution de NaOH diluée en ajoutant 50 μL de NaOH 0,1 M à 950 μL d’eau distillée. En tant que témoin négatif à blanc, ajouter 60 μL de cette solution à la plaque du puits en trois exemplaires (positions G1, G2, G3).
- Préparez les dilutions d’échantillons inconnus en ajoutant 50 μL de chaque solution d’échantillon à 950 μL d’eau distillée dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 mL. Ensuite, ajoutez 60 μL de chaque échantillon dilué dans la plaque du puits en trois exemplaires, en commençant par la position H1. Une plaque à 96 puits devrait permettre l’analyse de 6 étalons, 1 blanc et 25 échantillons inconnus lorsqu’elle est lue en trois exemplaires. Chaque plaque de puits analysée doit contenir son propre étalon IgG et des échantillons vierges.
- Ajouter 100 μL d’eau distillée à tous les puits d’échantillons blancs et inconnus. Maintenant, chaque puits doit contenir un total de 160 μL. À l’aide d’une pipette multicanaux (8 canaux), ajoutez 40 μL de colorant protéique Coomassie brilliant blue G-250 dans chaque puits de la première colonne de la plaque du puits. Mélangez le colorant avec les échantillons en plongeant plusieurs fois. Répétez l’opération pour toutes les autres colonnes, en remplaçant les pointes de pipette pour éviter toute contamination.
ATTENTION : Le bleu brillant Coomassie G-250 est un irritant et le contact avec la peau, les yeux ou les poumons doit être évité. Veuillez porter des gants pour éviter tout contact avec la peau. En cas de contact avec la peau, ce produit tachera.
- Utilisez une aiguille pour faire éclater les bulles présentes dans les puits, car elles peuvent interférer avec la lecture du spectrophotomètre de microplaques. Nettoyez l’aiguille pour éviter la contamination entre les puits. Laissez la microplaque incuber à température ambiante pendant 5 minutes.
- À l’aide d’un spectrophotomètre à microplaques, notez les valeurs d’absorbance de chaque puits à 595 nm.
Table 1. Calculs de la courbe standard pour le dosage des protéines solubles.La quantité de protéines dans chaque étalon est calculée en prenant la concentration de chaque étalon et en la multipliant par la quantité de solution étalon dans chaque puits (160 μL).
| Concentration en IgG (μg/μL) | Protéines dans les échantillons étalons (μg) |
| 0,0000 | 0 |
| 0,0125 | deux |
| 0,0250 | 4 |
| 0,0375 | 6 |
| 0,0500 | 8 |
| 0,1000 | 16 |
