Dosage colorimétrique pour la quantification des glucides non structurels dans les tissus végétaux

Résumé

Source : Deans, C. A. et al. Quantification de la teneur en protéines solubles dans les plantes et en glucides digestibles, en utilisant le maïs (Zea mays) comme exemple. J. Vis. Exp. (2018).

Cette vidéo décrit la méthode de quantification des glucides digestibles présents dans les tissus végétaux. Cela permet de collecter des données sur divers tissus végétaux pour étudier l’écologie nutritionnelle, les interactions plantes-herbivores et la dynamique du réseau trophique.

Protocole

1. Collecte et traitement des plantes

1. Après avoir prélevé des échantillons de plantes, congelez rapidement les échantillons en trempant la matière végétale dans de l’azote liquide à l’aide d’une pince et conservez-les à -80 °C. Si les échantillons de plantes prélevés sont trop gros pour être congelés, refroidissez-les rapidement à l’aide de glace sèche et transférez-les dans un congélateur à -80 °C dès que possible. La teneur en macronutriments du matériel végétal peut changer après que les tissus sont séparés de la plante, il est donc important de congeler les échantillons de plantes dès que possible après la collecte.
   prudence: L’azote liquide peut provoquer de graves engelures au contact de la peau. Assurez-vous de transporter l’azote liquide dans des contenants approuvés et de porter un EPI approprié lors de sa manipulation, y compris des gants cryogéniques, des lunettes de protection, un écran facial, un tablier et une blouse de laboratoire.
2. Lyophilisez le matériel végétal à l’aide d’un lyophilisateur pour vous assurer que les tissus sont métaboliquement inactifs pendant que l’eau est retirée. Sécher jusqu’à ce que la masse de l’échantillon se stabilise pour s’assurer que toute l’eau a été éliminée.
3. Une fois les échantillons secs, broyez-les en une poudre fine à l’aide d’un broyeur ou d’un broyeur. Stocker les échantillons dans une armoire de dessiccation jusqu’à l’analyse.

2. Dosage des glucides digestibles

1. Préparation des échantillons
   1. Peser des échantillons répétés de chaque tissu, d’environ 20 mg chacun, dans des tubes en verre de 15 mL munis de bouchons à vis recouverts de caoutchouc (longueur 100 mm). Ces échantillons seront par la suite qualifiés d’échantillons inconnus. Étiquetez les tubes avec un marqueur étanche ou avec du ruban adhésif sur les couvercles et notez la masse exacte de chaque échantillon, car cette information sera nécessaire pour calculer le % de glucides dans chaque échantillon inconnu.
2. Extrayez les glucides digestibles de chaque échantillon inconnu.
   1. Ajouter 1 mL de 0,1 M H₂SO₄ dans chaque tube et visser fermement les bouchons sur les tubes. Mettre au bain-marie bouillant pendant 1 heure.
      prudence: L’acide sulfurique est très corrosif. Veuillez porter des gants, des lunettes de protection et un tablier lors de la manipulation de H₂SO₄, et effectuer cette étape dans une hotte.
   2. Refroidissez les tubes dans un bain d’eau tiède. Verser le contenu du tube dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 ml étiquetés (ne pas s’inquiéter s’il reste de la matière végétale dans les tubes de verre).
   3. Tubes à centrifuger à 15 000 x g pendant 10 minutes. Retirer le liquide surnageant à l’aide d’une micropipette et le placer dans de nouveaux tubes à microcentrifuger de 1,5 mL étiquetés. Les tubes peuvent être réfrigérés pendant la nuit à ce stade. Si vous poursuivez l’analyse, reportez-vous à l’étape 2.3.2.
3. Mélanger des solutions étalons et quantifier la teneur totale en glucides digestibles d’échantillons inconnus.
   1. Préparer des solutions étalons de glucose D(+) aux concentrations indiquées dans le tableau 1. Préparez six tubes à essai en verre avec 400 μL de chaque solution étalon.
   2. Pipeter 15 μL de chaque échantillon inconnu dans son propre tube à essai et ajouter 385 μL d’eau distillée à chacun pour un volume total de 400 μL dans chaque tube à essai. Dans une hotte, ajouter 400 μL de phénol à 5 % dans chaque tube à essai d’échantillon étalon et inconnu, puis pipeter rapidement 2 mL de H₂SO₄ concentré dans chaque tube. Ne touchez pas le contenu du tube à essai avec la pointe de la pipette, ajoutez-le simplement à la surface de la solution (une pipette à répétition fonctionne mieux pour cela).
   3. Laissez les tubes incuber pendant 10 minutes, puis agitez soigneusement les tubes pour mélanger le contenu. Incuber pendant 30 minutes supplémentaires.
      prudence: Le phénol et l’acide sulfurique sont des irritants corrosifs. Pour protéger de l’exposition à la peau, aux yeux et à l’inhalation, cette étape doit être effectuée dans une hotte chimique à l’aide de l’EPI approprié, qui comprend : un écran facial ou des lunettes de protection, des gants en caoutchouc, un tablier de laboratoire et des bottes. Le mélange de phénol avec de l’acide sulfurique entraîne également une réaction exothermique, qui entraînera la chaleur des tubes.
   4. Pipette 800 μL d’échantillon de chaque tube dans chacune des 3 cuvettes semi-micro en polystyrène de 1,5 mL (3 répétitions techniques par échantillon). Réglez le spectrophotomètre pour qu’il lise à 490 nm. Étalonnez sur une cuvette vierge contenant de l’eau distillée avant de lire des étalons ou des échantillons inconnus, et par intermittence tout au long des lectures d’échantillons. Faites passer chaque cuvette dans un spectrophotomètre et enregistrez l’absorbance. Moyenne des répétitions techniques pour chaque échantillon inconnu.
      note: Dans certains cas, les échantillons peuvent dépasser le seuil supérieur d’absorbance. Si c’est le cas, les échantillons doivent être dilués à l’étape 1.3.1. Les dilutions doivent également être prises en compte dans les calculs ultérieurs.
   5. Calculer l’absorbance moyenne pour chaque étalon.
      note: Pour calculer la quantité de glucides digestibles totaux présents dans chaque échantillon inconnu à l’aide de la courbe standard, il est plus facile de faire régresser l’absorbance moyenne de chaque étalon par rapport aux microgrammes de D(+)glucose présents dans chaque étalon, mais on peut également tracer la concentration de D(+)glucose (μg/μL) de chaque étalon si nécessaire. Les calculs suivants se réfèrent toutefois à une courbe standard basée sur des microgrammes et non sur des concentrations (μg/μL).
   6. Calculez la courbe standard en traçant l’absorbance moyenne en fonction de la quantité totale de D(+)glucose (μg) dans chaque solution étalon. Ajustez une ligne de régression linéaire à ces données, puis utilisez l’équation suivante pour calculer la quantité totale de glucides (μg) dans chaque échantillon inconnu :
      M_c = (((A_x – b)/m)/(15))*1000
      M_c = μg de glucides dans l’échantillon
      A_x = absorbance moyenne d’un échantillon inconnu
      b = ordonnée à l’origine (droite de régression standard)
      m = pente (droite de régression standard)
      Le coefficient de corrélation de cette droite doit être supérieur à 0,98 et régulièrement proche de 0,99. Ensuite, utilisez l’équation suivante pour déterminer le pourcentage de glucides dans chaque échantillon :
      P_c = ((M_c/1000)/(M_i))*100
      P_c = % de glucides
      M_i = masse initiale de l’échantillon (mg)

Table 1. Calcul de la courbe standard pour le dosage des glucides digestibles. La quantité de glucose dans chaque étalon est calculée en prenant la concentration de chaque étalon et en la multipliant par la quantité de solution étalon dans chaque tube à essai (400 μL)

D(+)glucose Concentration (ug/uL)	D(+)glucose dans les échantillons étalons (ug)
0,0000	0
0,0375	15
0,0750	30
0,1125	45
0,1500	60
0,1875	75

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Lecteur de microplaques (spectrophotomètre)	Modèle Bio-Rad	680 XR