Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Essai de croissance de Toxoplasma à base de luciférase
- Ensemencez les fibroblastes du prépuce humain (HFF) 1 semaine avant l’inoculation du parasite pour vous assurer que les cellules hôtes sont complètement confluentes. Effectuez un test simulé dans une plaque transparente pour vous assurer que les parasites restent intracellulaires tout au long de la période d’évaluation.
note: Ici, le test est effectué dans des microplaques de 96 puits. Selon les besoins expérimentaux, il peut être mis à l’échelle jusqu’à des microplaques de 384 ou 1536 puits.
- Passez les parasites Toxoplasma dans les HFF confluents 2 jours avant l’utilisation en transférant ~0,3-0,4 mL de parasites entièrement lysés dans une fiole T25. Incuber les cellules hôtes infectées à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 2 jours.
- Seringue de 5 mL de parasites fraîchement lysés à travers une aiguille de sécurité de 21 G 5x pour libérer les parasites intracellulaires, puis passer à travers un filtre de 3 μm pour éliminer les débris de la cellule hôte. Rincez les parasites résiduels de la fiole à l’aide de 7 ml de milieu D10 sans rouge de phénol, puis passez-les de nouveau dans le filtre.
- Centrifuger les parasites à 1000 x g pendant 10 min à température ambiante (RT). Videz le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 10 mL de milieu D10 sans rouge de phénol.
- Compter les parasites à l’aide d’un hémocytomètre pour déterminer la concentration.
- Diluer les parasites à 1 x 104 parasites/mL pour la souche de type sauvage (WT). Pour les souches parasitaires déficientes en croissance, augmentez la concentration en conséquence pour observer une augmentation significative des signaux de la luciférase.
- Aspirez soigneusement le milieu à partir de microplaques de 96 puits pré-ensemencées avec des HFF et injectez 150 μL de resuspension de parasites dans des puits dans un format de trois colonnes et cinq rangées, ce qui représente trois répétitions techniques et cinq points temporels.
- Incuber la microplaque à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 4 h.
- Aspirez soigneusement le milieu des puits pour éliminer les parasites non envahis, puis remplissez les puits avec un milieu sans rouge de phénol RT dans chaque rangée (sauf pour la première rangée).
- Mélangez des volumes égaux de PBS et de tampon de dosage de luciférase 2x et diluez le substrat de luciférase à 12,5 μM.
- Ajouter 100 μL de substrat de luciférase diluée dans chaque puits de la rangée supérieure. Incuber les microplaques à RT pendant 10 min pour permettre aux cellules de se lyser complètement.
- Mesurez l’activité de la luciférase à l’aide d’un lecteur de microplaques. Les paramètres du lecteur de plaques sont répertoriés dans le Tableau 1. Chaque relevé représente le nombre initial de parasites envahis 4 h après l’infection.
- Répétez les étapes 1.9 à 1.12 pour chaque rang toutes les 24 h pendant 4 jours sans changer de milieu. Ces lectures reflètent le nombre total de parasites répliqués 24 h, 48 h, 72 h et 96 h après l’infection.
- Calculez les lectures moyennes à chaque point temporel et divisez-les par les lectures moyennes à 4 h pour déterminer les changements de pli dans la croissance du parasite au fil du temps.
- Tracez les données à l’aide d’un logiciel de création de graphiques.
- Pour calculer le temps de doublage, tracez les valeurs log2 des changements de pliage aux points temporels individuels pendant le temps d’incubation. Utilisez une fonction de régression linéaire pour calculer la pente, qui représente le temps de doublement de chaque déformation.
Tableau 1 : Paramètres du lecteur de microplaques pour la mesure de l’activité de la luciférase lors d’un test de croissance de Toxoplasma basé sur la luciférase
| Luciférase : | extrémité |
| Temps d’intégration : | 1 s |
| Jeu de filtres - Émission : | Pleine lumière |
| optique: | Retour au début |
| gagner: | 135 |
| Vitesse de lecture : | normal |
| retarder: | 100 ms |
| Hauteur de lecture : | 4,5 millimètres |
