Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Évaluation de l’efficacité de l’inhibition des composés chimiques contre la croissance de Toxoplasma
NOTE : Ici, l’évaluation de l’inhibition du LHVS dans la croissance de Toxoplasma est présentée à titre d’exemple. Huit concentrations différentes de LHVS sont testées, et trois répétitions techniques sont effectuées pour chacune des trois répétitions biologiques pour les souches RHΔku80 ::NLuc et RHΔku80Δcpl ::NLuc.
- Avant l’infection parasitaire, ensemencer les HFF dans des microplaques de 96 puits sous forme de trois rangées et neuf colonnes pour une répétition biologique par composé et par souche. Les cellules hôtes seront laissées se développer pendant au moins 7 jours avant d’être utilisées.
- Passez les parasites RHΔku80 ::NLuc et RHΔku80Δcpl ::NLuc pendant 2 jours avant utilisation.
- Passez les parasites Toxoplasma dans les HFF confluents 2 jours avant l’utilisation en transférant ~0,3-0,4 mL de parasites entièrement lysés dans une fiole T25. Incuber les cellules hôtes infectées à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 2 jours.
- Seringue de 5 mL de parasites fraîchement lysés à travers une aiguille de sécurité de 21 G 5x pour libérer les parasites intracellulaires, puis passer à travers un filtre de 3 μm pour éliminer les débris de la cellule hôte. Rincez les parasites résiduels de la fiole à l’aide de 7 ml de milieu D10 sans rouge de phénol, puis passez-les de nouveau dans le filtre.
- Centrifuger les parasites à 1000 x g pendant 10 min à température ambiante (RT). Videz le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 10 mL de milieu D10 sans rouge de phénol.
- Compter les parasites à l’aide d’un hémocytomètre pour déterminer la concentration.
- Diluer les parasites à 1 x 104 parasites/mL pour la souche de type sauvage (WT). Pour les souches parasitaires déficientes en croissance, augmentez la concentration en conséquence pour observer une augmentation significative des signaux de la luciférase.
- Remettre les parasites en suspension dans un milieu sans rouge de phénol à raison de 1 x 104 parasites/mL.
- Aspirer le milieu d’une plaque contenant des HFF confluents et inoculer chaque puits avec 150 μL de resuspension de parasite. Incuber la microplaque à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 4 h.
- Préparer des LHV à huit concentrations différentes dans un réservoir de 12 puits par dilution en série. En général, les concentrations sont divisées par trois selon la méthode de la dilution en série.
note: La concentration la plus faible est réduite de 6 561 fois par rapport à la concentration la plus élevée. Le changement de pli de la dilution peut être ajusté en conséquence en fonction des différentes propriétés de chaque composé.
- 4 h après l’infection, aspirer le milieu pour éliminer les parasites non envahis et remplir chaque puits des colonnes 2 à 9 avec 150 μL de milieu complété par du LHVS à différentes concentrations. Laissez la première colonne remplie de milieu régulier pour servir de témoin non traité.
- Incuber la microplaque à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 96 h supplémentaires.
- Aspirez soigneusement le milieu des puits pour éliminer les parasites non envahis, puis remplissez les puits avec un milieu sans rouge de phénol RT dans chaque rangée (sauf pour la première rangée).
- Mélangez des volumes égaux de PBS et de tampon de dosage de luciférase 2x et diluez le substrat de luciférase à 12,5 μM.
- Ajouter 100 μL de substrat de luciférase diluée dans chaque puits de la rangée supérieure. Incuber les microplaques à RT pendant 10 min pour permettre aux cellules de se lyser complètement.
- Mesurer l’activité de la luciférase de puits individuels.
- Faites la moyenne de l’activité de la luciférase de trois réplicats techniques provenant de puits de chaque concentration individuelle de LHVS.
- Divisez l’activité moyenne de la luciférase pour chaque concentration de LHVS par l’activité moyenne de la luciférase dérivée de parasites non traités pour calculer l’activité normalisée de la luciférase en pourcentage.
- Tracez l’activité normalisée de la luciférase en fonction des concentrations individuelles de LHVS à l’aide d’un logiciel graphique (figure 1). L’inhibition de la pyriméthamine contre la croissance du parasite est également mesurée en tant que contrôle. La pyriméthamine est un antibiotique clinique utilisé pour traiter la toxoplasmose aiguë en inhibant le métabolisme de l’acide folique dans Toxoplasma.
- Calculez les valeurs de CI50 pour des composés individuels à l’aide de la méthode intégrée dans le logiciel graphique, réponse normalisée par rapport à [inhibiteur], dans le cadre du programme de régression « dose-réponse-inhibition ». L’IC50 est calculé à l’aide de la formule suivante :
Y = 100/(1 + X/IC50)
Où : Y représente les activités normalisées de la luciférase des cellules infectées sous différentes concentrations d’inhibiteur, et X représente les concentrations individuelles d’inhibiteur.
