1. Préparation des liposomes
- Combinez les stocks de chloroforme des lipides dans des proportions appropriées pour imiter la membrane mitochondriale externe.
- Préparez 25 mg de mélange de lipides. Nous utilisons un mélange de lipides préalablement établi qui imite les membranes mitochondriales, composé d'un rapport molaire de 48:28:10:10:4 de phosphatidylcholine d'œuf de poule (PC), de phosphatidyléthanolamine (PE) d'œuf de poule, de phosphatidyl inositol (PI) de foie bovin, de 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-sérine synthétique (DOPS) et de 1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycérol synthétique (TOCL). Des exemples de calculs sont présentés dans le tableau 1.
- Amenez tous les stocks lipidiques à température ambiante avant l’ouverture, car cela limitera la condensation. Comme la plupart des laboratoires ne disposent pas d’un moyen précis de mesurer la concentration des lipides, toute eau absorbée par le stock de chloroforme modifiera la concentration du stock de lipides et donc le rapport des lipides utilisés dans le test.
- Comme les stocks de lipides sont présentés dans des ampoules en verre, transférez la quantité requise de lipides dans un flacon en verre à l’aide d’une seringue de 1 ml. Ajoutez 2 mg de dithiothréitol (DTT) dans le flacon pour prévenir l’oxydation des lipides. Agissez rapidement car l’évaporation du chloroforme modifiera la concentration du lipide.
- Transférez tout lipide restant dans un flacon en verre séparé et ajustez-le d’un septa PFTE. Ajoutez 2 mg de DTT dans le flacon, enveloppez-le de parafilm et conservez-le à -20 °C pour éviter l’oxydation des lipides. Essayez d’utiliser les lipides dans les 3 mois suivant le transfert dans les flacons. Pour éviter la contamination potentielle des stocks de chloroforme par le ruissellement des marqueurs, transférez les autocollants des ampoules d’origine dans les flacons en verre plutôt que d’étiqueter avec un marqueur.
- Évaporez le chloroforme sous un jet d’azote très doux tout en faisant tourner le flacon en verre en continu à la main dans une hotte, agissant essentiellement comme un rotovap manuel. Faites tourner le flacon à une vitesse constante (20-40 tr/min) à la main pour maintenir les lipides en mouvement. L’objectif est d’évaporer tout le chloroforme et d’obtenir une couche uniforme de lipides sur l’ensemble du flacon en verre.
prudence: Le chloroforme est neurotoxique, et cette étape doit être effectuée dans la hotte.
- Fixez une pipette Pasteur fraîche sur le tube d’azote. Ne laissez aucun des lipides éclabousser le flacon ou la pipette Pasteur. Dirigez l’embout vers le fond du flacon afin que l’air rebondisse sur le fond et pousse les lipides vers le centre du flacon. Obtenez un enrobage uniforme sur l’ensemble du flacon tout en évitant toute accumulation dans les coins ou par le bouchon. L’ensemble de ce processus prend environ 5 minutes.
- Au fur et à mesure que le mélange s’épaissit en une « perle » de lipides, guidez-le au centre du flacon en changeant l’angle du flacon. Une fois que la perle commence à devenir plus petite, augmentez légèrement le flux d’azote pour disperser la bille, en veillant à ce qu’aucun des lipides ne s’échappe du flacon.
- Retirez tout chloroforme restant sous vide.
- Placez le flacon en verre sur une pompe à vide domestique ou à membrane pendant 1 heure pour éliminer la majorité du chloroforme résiduel. Ces aspirateurs ne sont généralement pas assez puissants pour éliminer tout le chloroforme, mais ils peuvent mieux tolérer de petites quantités de solvant que les aspirateurs rotatifs.
- Mettre le flacon sous vide (<1 mTorr) pendant 12 à 16 h pour éliminer tout le chloroforme résiduel. Assurez-vous d’éviter de heurter le flacon pendant ce processus.
- Remettre les lipides en suspension dans 1,25 mL de tampon liposomale (50 mM HEPES KOH pH 7,5, 15 % de glycérol, 1 mM de DTT). Comme nous avons commencé avec 25 mg de lipides, cela donne une concentration de 20 mg/mL. Remettez complètement les lipides en suspension sans morceaux visibles. Si les lipides s’accumulent dans le coin du flacon, le processus peut être long.
- Agitez vigoureusement le flacon jusqu’à ce que l’échantillon soit lisse et laiteux. Nous constatons que si l’évaporation du chloroforme a été effectuée correctement la veille, ce processus prend environ 5 à 10 minutes.
- Pour assurer la remise en suspension complète des lipides, tournez sur une roue à température ambiante pendant 3 heures à ~80 tr/min. Retirez le flacon de la meule une fois toutes les heures pendant 1 minute de vortex pour assurer un mélange uniforme.
- Transférez soigneusement les lipides dans un tube de microcentrifugation propre de 1,5 ml. Effectuez 5 cycles de congélation-décongélation en utilisant de l’azote liquide pour geler et un bloc de chaleur de 30 °C pour décongeler. Cette étape permet de convertir les vésicules multilamellaires en vésicules unilamellaires.
- Extruder les lipides.
- Pendant les cycles de congélation-décongélation, préparez la mini-extrudeuse. Assemblez la mini-extrudeuse avec des supports de filtre de 10 mm et une membrane en polycarbonate de la taille de pores souhaitée (nous utilisons 200 nm). La taille du filtre affectera la taille du liposome, ce qui affectera la concentration de protéines nécessaires à la reconstitution (étape 2.3).
- Placez la mini-extrudeuse sur une plaque chauffante et portez la température de l’extrudeuse à 60 °C.
- Prélevez les lipides dans une seringue en verre étanche au gaz de 1 ml et placez-la soigneusement à l’une des extrémités de la mini-extrudeuse. Placez la seringue étanche au gaz vide de l’autre côté de la mini-extrudeuse. Laissez les lipides s’équilibrer à la température du support de l’extrudeuse pendant 5 à 10 minutes.
- Transférez les lipides dans la seringue alternée en poussant doucement le piston de la seringue remplie. Poussez la solution de la seringue alternative dans la seringue d’origine. Répétez ce processus de va-et-vient 15 fois, de sorte qu’au 15e passage, les lipides se terminent dans la seringue alternée. Surveillez le volume à chaque passage pour vous assurer qu’il n’y a pas de fuites.
- Préparez des aliquotes à usage unique des lipides, congelez-les dans de l’azote liquide et conservez-les à -80 °C. Les liposomes sont stables à -80 °C pendant plusieurs mois. Les reconstitutions nécessitent 10 μL de liposomes à la fois (étape 2.3.4), il est donc pratique de préparer des aliquotes de 10 μL ou 20 μL
.
2. Reconstitution de la protéine Msp1 et Model TA
- Préparez le tampon de reconstitution : 50 mM HEPES pH 7,5, 200 mM d’acétate de potassium, 7 mM d’acétate de magnésium, 2 mM de DTT, 10 % de saccharose, 0,01 % d’azoture de sodium, 0,2 à 0,8 % de Deoxy Big Chaps (DBC).
- Optimiser les conditions de reconstitution du nouveau lot de liposomes. La concentration de DBC et de biobilles nécessaires à une reconstitution optimale varie en fonction du lot de liposomes utilisé. Pour limiter la variabilité d’une préparation à l’autre, utilisez le même lot de DBC pour toutes les expériences. Lorsque vous modifiez un grand nombre de DBC, répétez le processus d’optimisation.
- Mettre en place une série de reconstitutions avec différentes concentrations de DBC (0,2 % - 0,8 %) et de biobilles (25 mg - 100 mg) à chaque fois qu’un nouveau lot de liposomes est préparé. Il est important de ne pas abaisser le DBC en dessous de la concentration micellaire critique (CMC) de ~0,12 %. Une fois les conditions optimisées, nous vous recommandons de collecter toutes les données en utilisant les mêmes conditions de préparation et de reconstitution des liposomes.
- Mesurer l’efficacité des diverses conditions de reconstitution à l’aide du test d’extraction décrit à l’étape 3.
- Préparer les biobilles à une concentration finale de 250 mg/mL.
- Pesez 2,7 g de billes de biobilles séchées et mettez-les en suspension dans un tube à centrifuger de 50 ml de méthanol à 100 % (environ 45 ml) pour mouiller les billes. Mouillez d’abord les biobilles dans du méthanol pour éviter que l’air ne soit piégé dans les pores des billes. Une fois dans le méthanol, gardez les biobilles humides, car l’air emprisonné par les biobilles modifiera leur capacité à absorber le détergent.
- Éliminez le méthanol en lavant les billes 8 fois avec environ 45 mL d’eau ultrapure (18,2 mΩ), ci-après dénommée ddH2O. Perles de granulés en les essorant à 3 200 x g pendant 1 minute. Décantez le liquide et mettez-le en suspension dans ddH2O.
- Après le lavage, remettre en suspension dans 10 ml de ddH2O avec de l’azoture de sodium à 0,02 % et conserver à 4 °C. Les biobilles peuvent être conservées à 4 °C pendant plusieurs mois. Cette quantité est de 250 mg/mL, car on suppose que ~0,2 g est perdu pendant les étapes de lavage.
- Calculez la taille du liposome et le nombre souhaité de molécules de protéine TA et de Msp1 par liposome. Cela déterminera la concentration des protéines Msp1 et TA nécessaire à la reconstitution.
- Tout d’abord, calculez le nombre de molécules lipidiques par liposome unilamellaire (Ntotal) à l’aide de l’équation
%20a%20%C3%A9t%C3%A9%20obtenue.</li>%0A%09%09%09<li>Utilisez%20une%20valeur%20de%205%20nm%20pour%20h%20et%20de%200,71%20nm<sup>2</sup>%20pour%20<em>a</em>,%20qui%20est%20la%20taille%20du%20groupe%20de%20t%C3%AAte%20pour%20la%20phosphatidylcholine.%20Dans%20cette%20situation%20particuli%C3%A8re,%20le%20<em><sub>total</sub>%20de%20N</em>%20est%20de%2037%20610.</li>%0A%09%09</ol>%0A%09%09</li>%0A%09%09<li>Ensuite,%20calculez%20la%20concentration%20molaire%20du%20lipide%20<em>M<sub>Lipide</sub></em>%20%C3%A0%20l%E2%80%99aide%20du%20poids%20mol%C3%A9culaire%20moyen%20des%20lipides%20dans%20le%20m%C3%A9lange.%20Dans%20cet%20exemple,%20la%20concentration%20des%20lipides%20est%20de%2020%20mg/mL%20(<strong>%C3%A9tape%201.4</strong>)%20et%20le%20poids%20mol%C3%A9culaire%20moyen%20des%20lipides%20est%20de%20810%20g/mol%20(<strong>tableau%201</strong>).%20Il%20en%20r%C3%A9sulte%20une%20valeur%20de%200,0247%20M%20pour%20<em><sub>M%20Lipid.</sub></em></li>%0A%09%09<li>Ensuite,%20calculez%20la%20concentration%20molaire%20des%20liposomes,%20<em><sub>Liposome</sub></em>%20M,%20%C3%A0%20l%E2%80%99aide%20de%20l%E2%80%99%C3%A9quation<br%20/>%0A%09%09<img title= "figure-protocol-1")
3. Dosage de l’extraction
- Préparer les tubes pour l’analyse de la FDS PAGE. Chaque réaction aura 4 tubes : INPUT (I), FLOW THROUGH (FT), WASH (W) et ELUTE (E).
- Ajoutez 45 μL d’échantillon ddH2O dans le tube INPUT, 40 μL de ddH2O dans le tube FLOW THROUGH et 0 μL dans les tubes WASH et ELUTE.
note: Le meilleur rapport signal/bruit dans ce test est obtenu lorsque les échantillons WASH et ELUTE sont concentrés 5 fois par rapport aux échantillons INPUT et FLOW THROUGH. En raison des dilutions pendant l’essai, cela nécessite de prélever 5 μL d’échantillon pour l’échantillon INPUT, 10 μL d’échantillon pour l’échantillon FLOW THROUGH et 50 μL d’échantillon pour les échantillons WASH et ELUTE.
- Ajoutez 16,6 μL de 4 tampons de chargement SDS PAGE dans chaque tube. Le volume total de chaque échantillon est de 50 μL avant la mémoire tampon de chargement SDS PAGE. Le volume final est de 66,6 μL (50 μL d’échantillon + 16,6 μL de 4x tampon de chargement SDS PAGE).
- Assemblez le test d’extraction.
- Préparez la réaction d’extraction contenant 60 μL de protéoliposomes pré-autorisés, 5 μM de GST-SGTA, 5 μM de GST-Calmoduline et 2 mM d’ATP. Combinez tous les réactifs sauf l’ATP, qui est utilisé pour initier la réaction. Amener à un volume final de 200 μL avec Extraction Buffer.
note: Comme 60 μL d’échantillon sont utilisés pour chaque test d’extraction, une reconstitution peut être utilisée pour trois tests d’extraction différents. Effectuez des contrôles positifs et négatifs (+ATP et -ATP) sur le matériau à partir de la même reconstitution.
- Dosage de préchauffage de l’extraction dans un bloc thermique de 30 °C pendant 2 minutes.
- Lancez le test d’extraction en ajoutant de l’ATP à la concentration finale de 2 mM et démarrez le compte à rebours.
- Faites tourner une image de 5 secondes pour mélanger l’ATP dans la réaction. Incuber la réaction à 30 °C pendant 30 minutes.
- Pendant l’incubation, prélever 5 μL de la réaction et l’ajouter dans le tube INPUT. Le calendrier est flexible.
- Pendant cette période d’incubation, équilibrer une colonne de spin de glutathion pour chaque échantillon dans le test d’extraction.
- Effectuer une descente sur les chaperons pour isoler le matériel extrait.
- Une fois l’incubation de 30 minutes terminée, ajoutez 200 μl de tampon d’extraction dans le tube pour porter le volume total à 400 μL. Ajouter à la résine de glutathion équilibrée et laisser se lier sur la roue à 4° C pendant 30 minutes.
- Faites tourner les colonnes à 700 x g pendant 2 minutes à température ambiante pour recueillir le flux. Prendre 10 μL pour le tube FLOW THROUGH. Cet échantillon contient des substrats qui sont encore intégrés dans la bicouche lipidique.
- Lavez la résine deux fois avec 400 μL de tampon d’extraction, en éliminant le flux. Lors du troisième lavage, maintenez le débit et prélevez 50 μL pour le tube WASH.
- Préparez 5 mL de tampon d’élution en ajoutant du glutathion réduit à une concentration finale de 5 mM dans le tampon d’extraction. Préparez ce tampon frais à chaque fois.
- Ajoutez 200 μL de tampon d’élution à la colonne d’essorage. Incuber à température ambiante pendant 5 minutes. Essorer à 700 x g pendant 2 minutes à température ambiante pour éluer. Gardez le flux. Répétez le processus une deuxième fois de sorte que le volume total d’élution soit de 400 μL.
- Prélever 50 μL d’échantillon dans l’échantillon d’élution et l’ajouter dans le tube d’éluée.
| lipide | Mole % | Mw | MW moyen | μmol dans 25 mg | mg dans 25 mg | Stock de chlore (mg/mL) | μL pour 25 mg |
| PC | 48 % | 770 | 369,6 | 14,82 | 11,41 | 25 | 456,4 |
| Pe | 28 % | 746 | 208,88 | 8,64 | 6,45 | 25 | 258,0 |
| pi | 10 % | 902 | 90,2 | 3.09 | 2,78 | 10 | 278,5 |
| DOPS | 10 % | 810 | 81 | 3.09 | 2,50 | 10 | 250,1 |
| Nomenclature | 4 % | 1502 | 60.08 | 1,23 | 1,85 | 25 | 74,2 |
| Conc. Corr Moy MW | 809.76 |
| μmol dans 25 mg | 30.87 |
Tableau 1 : Calculs d’échantillons pour la préparation des liposomes. Les principaux objectifs de ce tableau sont de calculer le poids moléculaire moyen corrigé en fonction de la concentration du mélange de lipides et le volume de chaque stock de lipides nécessaire à la fabrication des liposomes. La MW et la concentration des stocks proviennent des étiquettes des produits. Les lipides et le % molaire sont choisis par l’utilisateur.
