Dosage de la β-galactosidase pour évaluer la cytotoxicité induite par les médicaments chez les parasites

Dans cet article

Résumé

Source : Alonso, V. L. et al. In Vitro Dépistage de drogues contre tous les stades du cycle de vie de Trypanosoma cruzi à l’aide de parasites exprimant la β-galactosidase. J. Vis. Exp. (2021)

Dans cette vidéo, nous décrivons une méthode simple et robuste pour déterminer le potentiel cytotoxique d’un médicament trypanocide contre un parasite, Trypanosoma cruzi, exprimant l’enzyme β-galactosidase. La β-galactosidase sert d’indicateur de lyse cellulaire, et son activité peut être utilisée pour évaluer les effets du médicament.

Protocole

1. Dosage de la β-galactosidase

REMARQUE : La quantification de l’activité de la β-galactosidase est utilisée comme moyen indirect de déterminer le nombre de parasites. On s’attend à ce que la croissance soit inhibée en présence d’un composé trypanocide, ce qui entraînera un nombre plus faible de parasites par rapport au témoin non traité, ce qui se traduira par une activité plus faible de la β-galactosidase et donc une absorbance plus faible.

Incuber les parasites avec BZN
1. Ajouter 100 μL de solution de benznidazole (BZN) correspondante par puits pour atteindre une concentration finale de BZN de 80, 40, 20, 10, 5 et 2,5 μM à 100 μL de suspension d’épimastigote, de cellules Vero avec des amastigotes (2 jours après l’infection) ou de trypomastigotes dans une plaque à 96 puits.
2. Incuber les épimastigotes à 28 °C pendant 72 h, et les trypomastigotes ou les cellules Vero infectées avec des amastigotes pendant 24 h à 37 °C et 5 % de CO₂.
  note: Chaque concentration de médicament doit être évaluée au moins en trois exemplaires et inclure des cultures témoins d’épimastigotes, de trypomastigotes et de cellules Vero infectées par le diméthylsulfoxyde (DMSO).
Réaction colorimétrique
1. Après la période d'incubation du traitement, si des cellules Vero ou des trypomastigotes infectés sont dans le milieu Modified Eagle Medium (DMEM) de Dulbecco avec du rouge de phénol, remplacez le milieu par 100 μL de 1x PBS pour éviter les interférences. Réaliser des puits vierges triples contenant seulement 100 μL de milieu correspondant (ou 1x PBS selon le cas).
  note: Il n’est pas nécessaire de retirer le milieu de culture pour les épimastigotes dans le cas d’un milieu LIT ou DMEM sans rouge de phénol. Le DMEM avec du rouge de phénol peut toujours être utilisé ; préparer un puits à blanc avec du DMEM seul pour mesurer l’absorbance de base, puis soustraire cette valeur lors de l’analyse des données. Le milieu anti-insectes de Schneider, qui est incolore, est une alternative aux épimastigotes.
2. Ajouter 40 μL de solution de substrat de rouge de chlorophénol β-D-galactopyranoside (CPRG) et 10 μL de solution détergente dans chaque puits, obtenant une concentration finale de 200 μM de CPRG et 0,1 % de détergent dans un volume final de 250 μL dans chaque puits.
  note: La solution CPRG et le détergent peuvent être additionnés dans un volume final de 50 μL par puits.
3. Incuber à 37 °C pendant 2 h et mesurer l’absorbance à 595 nm dans un spectrophotomètre à microplaques.
  note: Le changement de couleur attendu est jaune à brun rougeâtre lors du clivage enzymatique de la β-galactosidase (Figure 1A). Le temps d’incubation peut être prolongé jusqu’à 4 h, et les spectres d’absorbance du rouge de chlorophénol peuvent être lus entre 570 et 595 nm avec un ajustement de courbe similaire. L’incubation jusqu’à 24 h en présence du substrat CPRG a montré des ajustements de courbe similaires.

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Résultats

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Figure 1 : Calcul de la valeur CI50 du benznidazole pour la forme d’épimastigote Dm28c. (A) Une plaque à 96 puits avec des épimastigotes traités avec différentes concentrations de BZN (2,5, 5, 10, 20, 40 et 80 μM) avant l’ajout de CPRG (1), après l’ajout initial de CPRG et de détergent (2), et après l’incubation avec CPRG et détergent montrant le changement de couleur (3). (