Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Libération ex-vivo de monoamine endogène à partir de tranches ou de poinçons de cerveau
REMARQUE : Le dispositif utilisé pour cette section se compose d’une plaque à 48 puits et d’un porte-mouchoir composé de six unités de filtration de microcentrifugeuse sans les filtres encastrés reliés à une conduite de carbogène (Figure 1). Pour fabriquer le support, utilisez une tige en plastique solide (par exemple, d’un grattoir de cellule) et collez les unités de filtration de la microcentrifugeuse sans les filtres encastrés. Laissez sécher pendant 1 à 2 jours. Le temps requis pour l’expérience de libération endogène de monoamines et les concentrations d’amphétamine, de fluoxétine et de cocaïne sont basés sur la littérature actuelle et les protocoles précédents.
- Activation tissulaire
- Transférez le tissu cérébral dans chaque puits de la chambre d’efflux et laissez la récupération pendant 30 à 50 min à 37 °C sur un chauffe-lames dans 0,5 à 1 mL de tampon d’efflux oxygéné, avec des bulles constantes et douces (Figure 1B1).
- Au cours de cette incubation, diluez les médicaments à la concentration souhaitée pour l’expérience. Tous les médicaments doivent être dissous dans un tampon d’efflux, et les concentrations sont basées sur la littérature actuelle.
- Première incubation
- Déplacez le support de tissu avec du tissu cérébral dans des puits contenant 500 μL de tampon d’efflux oxygéné et incubez pendant 20 min à 37 °C. Assurez-vous qu’un minimum ou pas de tampon est transporté en tapotant le support sur le bord du puits jusqu’à ce qu’il n’y ait plus d’excès de tampon dans le support.
- Dans les expériences avec des agents pharmacologiques tels que les inhibiteurs du transporteur de monoamines, incuber les échantillons de tissus avec les drogues diluées dans un tampon d’efflux oxygéné (p. ex., 10 μM de fluoxétine, 40 μM de cocaïne ; voir la figure 1B2). Le volume final dans chaque puits sera de 500 μL.
- Deuxième incubation
- Déplacez le support avec le tissu vers un nouvel ensemble de puits contenant 500 μL de tampon d’efflux total avec ou sans la concentration souhaitée de chaque médicament. Assurez-vous qu’il n’y a pas d’excédent de mémoire tampon. Chaque puits représente un n = 1 pour les conditions expérimentales. Chaque condition expérimentale est réalisée en trois exemplaires.
- Un puits comprend un tampon d’efflux oxygéné, le suivant 10-30 μM AMPH, et le dernier puits comprend 10-30 μM AMPH plus des inhibiteurs de transporteur de monoamines. Chaque médicament est dissous dans un tampon d’efflux oxygéné.
- Incuber le tissu pendant 20 min à 37 °C avec 500 μL de la condition médicamenteuse.
note: D’autres puits peuvent inclure un tampon d’efflux oxygéné à haute teneur en K+ avec ou sans inhibiteurs du transporteur de monoamines. Dissoudre chaque médicament dans le tampon d’efflux oxygéné (500 μL).
- Au cours de cette deuxième incubation de 20 min, recueillir la solution dans les puits de la première incubation à l’étape 1.2.1 et la transférer dans des tubes de microcentrifugation contenant 50 μL d’acide perchlorique 1 N ou d’acide phosphorique (selon le type de CLHP, concentration finale 0,1 N). Le volume final de l’échantillon sera de 550 μL. Maintenez les tubes de microcentrifugation sur de la glace et étiquetez les tubes #1.
- Après la deuxième incubation de 20 min, déplacez le porte-mouchoir avec des sections de cerveau ou des poinçons vers un puits vide et maintenez la plaque sur de la glace. Transvasez le surnageant dans des tubes de microcentrifugation contenant 50 μL d’acide perchlorique 1 N ou d’acide phosphorique. Le volume final de l’échantillon sera de 550 μL. Maintenez les tubes de microcentrifugation sur de la glace et étiquetez les tubes #2.
- Ajouter 1 mL de tampon de dissection glacé dans chaque puits contenant du tissu. Prélevez tous les tissus à l’aide d’une petite pince à épiler et transférez-les dans des tubes de microcentrifugation propres.
- Maintenir les tubes contenant du tissu cérébral à -80 °C. Jeter le tampon de dissection de 1 mL (Figure 1B4).
- Solutions filtrantes obtenues à partir de chaque incubation à l’aide de tubes filtrants de microcentrifugation (0,22 μm) à 2 500 x g pendant 2 min. Utilisez le filtrat pour déterminer la teneur en monoamines à l’aide de la CLHP avec détection électrochimique (figure 1B5).
