Toutes les procédures animales décrites ici ont été approuvées par le comité de base et d’utilisation de l’établissement de l’Icahn School of Medicine at Mount Sinai.
1. Préparation avant l’isolement des cellules valvulaires chez des souris adultes
- Nettoyez et stérilisez tous les instruments chirurgicaux illustrés à la figure 1A en utilisant de l’éthanol à 70 % v/v, puis en les autoclavant pendant 30 min. Nettoyez l’espace de travail chirurgical avec de l’éthanol à 70 %.
- Ajouter 500 μL de pénicilline-streptomycine à 50 mL de HEPES de 10 mm. Préparez une aliquote de 50 mL de 1 solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Gardez les solutions sur la glace.
- Préparez des solutions de collagénase de 1 mg/mL et 4,5 mg/mL et utilisez 5 mL de chaque solution dans des tubes de 15 mL pour effectuer toute la procédure. Pour préparer 5 mL de collagénase à 1 mg/mL, mélangez 5 mg de collagénase avec 2,5 mL de milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM, sans sérum fœtal bovin (FBS)) et 2,5 mL de 10 mM HEPES complété par des antibiotiques (1 % de pénicilline-streptomycine de l'étape 1.2). Filtrer les solutions à travers un filtre de 0,22 μm pour éliminer toute contamination.
REMARQUE : Gardez les solutions sur de la glace pour protéger les enzymes.
- Réchauffez la solution DMEM à 37 °C avant de l’utiliser dans toutes les étapes décrites ci-dessous. Préparez le milieu complet en complétant le DMEM avec 1 % de pénicilline-streptomycine, 1 % de pyruvate de sodium, 5 ml de 200 mM de L-glutamine, 1 ml de réactif d’élimination des mycoplasmes (voir le tableau des matières) et 10 % de FBS.
2. Isolation des cellules de vanne
- Pour obtenir 10cellules 5 pour l’expérience, utilisez cinq souris âgées de 8 semaines (minimum de trois). Placez la souris dans une chambre d’induction avec un petit morceau de papier de soie imbibé de 1 ml d’isoflurane, mais ne laissez pas entrer en contact avec le tissu. Pour confirmer que l’animal est complètement anesthésié ; Vérifiez le réflexe de pincement de l’orteil, puis euthanasiez la souris par luxation cervicale. Utilisez l’isoflurane pour soulager toute douleur avant la luxation cervicale, car la procédure décrite ci-dessous est terminale.
- Placez la souris sur une plate-forme de dissection et fixez les pattes avec des canules pour la maintenir en place. Nettoyez la poitrine et l’abdomen avec de l’éthanol ; Ouvrez l’abdomen et la poitrine avec des ciseaux. Avec de petits ciseaux chirurgicaux, coupez entre l’oreillette gauche et le ventricule gauche pour exsangler la souris. Perfuser le cœur avec 10 ml de PBS froid pour éliminer le sang du cœur.
- Coupez le cœur et tenez-vous à 3 mm de l’aorte ascendante, comme le montre la figure 1B. Disséquez la valve aortique au stéréomicroscope. Coupez le cœur horizontalement au milieu des ventricules (Figure 1C). Coupez le ventricule gauche vers l’aorte et disséquez soigneusement la valve aortique (Figure 1D-F). Regroupez les vannes dans une petite boîte de culture tissulaire de 35 mm.
- Laver les valves isolées dans une boîte de culture cellulaire de 75 mm avec 5 mL de HEPES froid (10 mM) complété par des antibiotiques (1 % de pénicilline-streptomycine) pour prélever le sang (Figure 2). Préparez deux tubes de 15 mL de collagénase à 1 mg/mL et 4,5 mg/mL comme décrit ci-dessus à l’étape 1.3.
note: Après la dissection, manipulez les valves isolées dans une hotte de biosécurité stérile pour minimiser la contamination.
- Incuber les valves dans la collagénase de type I (1 mg/mL) pendant 30 min à 37 °C en agitant continuellement (Figure 2). Centrifugez le tube pendant 5 min à 150 × g, lavez une fois la pastille avec 2 mL de HEPES (10 mM) et tourbillonnez pendant 30 s à grande vitesse. Versez le contenu de ce tube dans une boîte de culture de 35 mm et transférez soigneusement les fragments de tissu à l’aide d’une pince à épiler fine dans un nouveau tube.
note: À ce stade, les CIV ne sont toujours pas dissociées du tissu et la pastille contient des morceaux de tissu. Pour éviter la contamination par des cellules endothéliales, ne centrifugez pas après le vortex à l’étape 2.5.
- Incuber la pastille dans un tube de 15 mL contenant 5 mL de collagénase de type I (4,5 mg/mL) à 37 °C sous agitation continue pendant 35 min. Remettre les cellules en suspension à l’aide d’une pipette de 1 mL pour séparer les cellules, puis centrifuger à 150 × g pendant 5 min à 4 °C.
- Jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 2 mL de DMEM complet. Centrifuger à 150 × g pendant 5 min à 4 °C. Répéter cette étape deux fois pour nettoyer les cellules.
note: La pastille aura encore quelques fragments de tissu.
- Remettre la pastille en suspension dans 1 mL de milieu complet et placer les cellules dans un puits d’une boîte de culture cellulaire à 6 puits dans une quantité minimale de milieu pour faciliter leur fixation à la boîte de culture. Laissez les cellules, sans être dérangées, dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de dioxyde de carbone.
- Après 3 jours, vérifiez les cellules au microscope pour vérifier une bonne croissance à proximité des débris tissulaires. Une fois que 1 000 cellules sont visibles au microscope, retirez soigneusement les débris de tissu à l’aide d’une pince à épiler autoclave et changez de support.
note: La plaque ne doit pas être dérangée ; Si le nombre requis de cellules n’est pas observé, remettez la boîte de culture cellulaire dans l’incubateur pendant encore 2 jours.
- Lorsque les cellules sont confluentes à 70 % (2,5 × 105), trypsiniser puis les transférer dans une boîte de culture tissulaire de 75 mm.
3. Essai de calcification in vitro
- Nettoyez la hotte avec de l’éthanol à 70 %, réchauffez le DMEM à 37 °C.
- Ensemencer 100 000 cellules/condition dans des plaques à 6 puits dans du DMEM complet, et cultiver pendant 24 h à 37 °C.
- Préparez le milieu calcifiant en mélangeant 2 mM de NaH2PO4, 10-7 M d’insuline et 50 μg/mL d’acide ascorbique dans du DMEM avec 5 % de FBS. Pour 93 ml de DMEM, ajouter 5 ml de FBS, 1 ml d’antibiotiques (concentration finale de 1 %), 1 ml de pyruvate de sodium (100 mM), 27,5 mg de NaH2PO4, 5,8 μL d’insuline et 5 mg d’acide ascorbique.
REMARQUE : Filtrez la solution à l’aide d’un filtre de 0,22 μm avant utilisation.
- Après 24 h, remplacer le milieu surnageant par le milieu calcifiant. Incuber les cellules pendant 7 jours à 37 °C. Le 3ème jour, remplacez par un milieu calcifiant frais, et remettez la plaque dans l’incubateur pour terminer les 7 jours de traitement.
- Après 7 jours, retirez le milieu et lavez les cellules deux fois avec 2 mL de 1x PBS. Incuber les cellules dans 1 mL d’acide chlorhydrique (HCl) 0,6 N pendant 24 h à 37 °C. Recueillir le HCl dans un tube de 1,5 mL et l’évaporer dans un évaporateur rotatif. Remettre en suspension le contenu de tous les tubes dans 60 μL de HCl.
note: La procédure de séchage est importante pour concentrer la solution et avoir le même volume pour chaque condition.
- Utilisez une plaque à 96 puits pour mesurer la concentration de calcium à l’aide du réactif Arsenazo III, disponible dans un kit prêt à l’emploi (voir le tableau des matériaux pour plus de détails).
- Préparez une solution étalon de calcium à 10 mg/dL. Peser 10 mg d’hydroxyde de calcium (Ca(OH)2) et dissoudre dans 100 mL d’eau distillée.
- Dans une plaque transparente à 96 puits, pipeter 2 μL de solution à blanc (HCl, 0,6 N), la solution étalon, l’échantillon par puits (10 mg/dL) et les échantillons. Réaliser l’expérience en trois exemplaires pour vérifier la variabilité du pipetage. Ajouter 200 μL de réactif pour chaque condition.
note: Les échantillons supérieurs à 15 mg/dL doivent être dilués 1:1 avec une solution saline, réanalysés et le résultat multiplié par deux.
- Incuber la réaction pendant 15 min à température ambiante.
note: La réaction est stable pendant 60 min.
- Lire et enregistrer l’absorbance de la plaque à 650 nm. Utilisez la formule suivante pour calculer la quantité de calcium dans les échantillons :
Calcium (mg/mL) = (Absorbance de l’échantillon/Absorbance de l’étalon) × Concentration de l’étalon
