Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Échantillonnage des PM2.5 et extraction des composés organiques
REMARQUE : Les PM2,5 ont été collectées dans une zone urbaine de Suzhou, en Chine, du 1er au 7 août 2015, comme décrit précédemment.
- Faites cuire des filtres à membrane en quartz de 47 mm dans un four à moufle à 500 °C pendant 2 h pour éliminer les composants organiques.
- Placez un filtre dans un échantillonneur de PM2,5 pour 24 h d’échantillonnage ininterrompu.
- Retirez le filtre et faites sécher pendant 24 h à température ambiante.
- Quantifiez le filtre à l’aide d’une balance analytique.
- Extraire les composants organiques du filtre par extraction Soxhlet en utilisant du dichlorométhane comme solvant.
- Séchez l’EOM par évaporation rotative dans un bain d’eau à 60 °C et un écoulement d’azote. Dissoudre l’EOM dans le DMSO et le conserver à -20 °C.
2. Collecte et traitement des embryons de poisson-zèbre
- Maintenir le poisson-zèbre à 28,5 ± 0,5 °C dans un système d’aquaculture en recirculation avec un cycle photopériodique de 14 h de lumière et 10 h d’obscurité.
- Placez des poissons-zèbres adultes en bonne santé dans un réservoir selon un rapport mâle/femelle de 2:1.
- Le lendemain, collectez les embryons et lavez-les avec de l’eau du système (c’est-à-dire de l’eau de reproduction du poisson-zèbre).
- Sélectionnez et divisez au hasard les embryons de poisson-zèbre présentant un développement normal (taille uniforme, grains pleins et pas de coagulation des œufs) en 4 groupes dans des boîtes de Pétri individuelles en verre d’un diamètre de 7 cm (environ 50 embryons par boîte).
- Traiter les embryons avec des PM2,5 (5 mg/L) en présence ou en absence de NAC à 0,25 μM de 2 hpf à 72 hpf. Utiliser le DMSO comme contrôle du véhicule jusqu’à une concentration finale de 0,1 % (v/v).
3. Observation morphologique d’embryons de poisson-zèbre et dissection cardiaque
- À 72 hpf, transférez les embryons sur des lames de verre et observez au stéréomicroscope. Enregistrez les malformations cardiaques, telles que l’œdème péricardique, l’altération de l’enroulement et la diminution de la taille.
- Calculer les taux de malformations (le pourcentage d'embryons présentant des malformations cardiaques par rapport au total des embryons vivants) et analyser les différences entre les groupes à l'aide de l'ANOVA à un facteur suivie du test de comparaison multiple de la Turquie (p < 0,05 = statistiquement significatif).
- Anesthésier les embryons avec 0,6 mg/mL de MS-222 pour les immobiliser sur des lames de verre.
- Enregistrez les battements cardiaques pendant 30 s et quantifiez les fréquences cardiaques à l’aide du logiciel ImageJ.
- Disséquez les cœurs d’embryons de poisson-zèbre à l’aide d’une aiguille de seringue jetable sous un stéréomicroscope. Attention : Évitez de détruire la forme du cœur.
4. Dosage de l’immunofluorescence
- Pour utiliser un test d’immunofluorescence afin de détecter les dommages à l’ADN induits par les PM2,5 au cœur des embryons de poisson-zèbre, utilisez un stylo-barrière hydrophobe pour dessiner un cercle sur un côté en verre propre.
- Ajouter 50 μL de paraformaldéhyde à 4 % à 1,25 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour obtenir une solution fixatrice.
- Placez 3 cœurs disséqués dans un cercle de stylo barrière hydrophobe et incubez pendant 20 min à température ambiante.
- Décantez la solution au microscope et séchez les échantillons à température ambiante pendant au moins 5 min, de sorte que les cœurs se fixent complètement aux lames de verre.
- Lavez les lames trois fois dans du PBS avec 0,1 % de Tween 20 (PBST) pendant 5 minutes par lavage.
- Ajouter 50 μL d’albumine sérique bovine (BSA) à 1000 μL de PBST pour obtenir une solution BSA à 5 % et incuber les lames dans une chambre humide pendant 1 h pour bloquer la liaison des anticorps non spécifiques.
- Décanter la solution et laver les échantillons trois fois avec du PBST pendant 5 minutes par lavage.
- Diluer 2 μL d’anticorps monoclonaux de souris contre le 8-OHdG et 2 μL d’anticorps polyclonaux de lapin contre γH2AX dans 296 μL de PBST pour obtenir une solution de cocktail d’anticorps primaires fonctionnelle.
- Incuber les échantillons cardiaques avec 50 μL de la solution cocktail d’anticorps primaires contre le 8-OHdG et le γH2AX dans une chambre humidifiée pendant au moins une heure à température ambiante ou toute la nuit à 4 °C (l’incubation pendant la nuit peut augmenter l’intensité du signal).
- Décanter la solution et laver les échantillons trois fois avec du PBST pendant 5 minutes par lavage.
- Diluer 1 μL d’anticorps secondaire anti-souris de chèvre marqué au FITC et 1 μL d’anticorps secondaire anti-lapin de chèvre cy3 dans 498 μL de PBST pour obtenir une solution cocktail d’anticorps secondaires fonctionnelle et incuber les échantillons avec les anticorps secondaires (1:500 dans le PBST) pendant 1 h à température ambiante dans l’obscurité.
- Décantez la solution et lavez les échantillons trois fois avec du PBS pendant 5 min par lavage à l’abri de la lumière.
- Ajouter 20 μL de DAPI (4',6-diamidino-2-phénylindole) aux échantillons pour la coloration nucléaire pendant 30 min à température ambiante.
- Appliquez une lamelle sur glisser et scellez avec du vernis à ongles pour éviter le dessèchement et le mouvement. Ensuite, imagez les échantillons à l’aide d’un microscope à fluorescence et quantifiez le signal de fluorescence de la zone cardiaque à l’aide du logiciel ImageJ. Calculez les changements relatifs avec la moyenne des échantillons de contrôle DMSO. Déterminez la signification statistique des données comme à l’étape 3.2.
