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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation des tranches de cortex rhinal-hippocampe
NOTE : La préparation des tranches de cortex rhinal-hippocampe utilise des rats Sprague-Dawley P6-7.
- Mise en place de la culture et préparation du milieu
- La veille de la culture, préparez le milieu requis et placez-le à 4 °C.
- Préparez le milieu de dissection : 25 mM de glucose dans la solution saline équilibrée de Gey (GBSS).
- Préparez le milieu de culture : 50 % d’Opti-MEM, 25 % de HBSS, 25 % de sérum de cheval (HS), 25 mM de glucose, 30 μg/mL de gentamycine.
- Préparez le milieu d’entretien : Neurobasal-A (NBA), 2 % B27, 1 mM de L-glutamine, 30 μg/mL de gentamycine, HS (15 %, 10 %, 5 % et 0 %).
- Prélèvement cérébral
- Juste avant de commencer la culture, ajoutez 1,1 mL de milieu de culture dans chaque puits de la plaque à 6 puits avec une pipette P1000 et placez-le à 37 °C.
- Placez tout l’équipement (microscope de dissection, hachoir à tissus, lampe de dissection, outils de dissection, électrodes, plaques, inserts et papiers-filtres) à l’intérieur de l’enceinte de sécurité biologique et stérilisez à la lumière UV pendant 15 minutes.
- Ajustez l’épaisseur de la tranche à 350 μm.
- Retirez le GBSS du réfrigérateur. Ajouter 5 ml de GBSS dans six boîtes de Pétri. Six boîtes de Pétri seront nécessaires par animal.
- Euthanasier le petit rat. Effectuez la décapitation à l’aide d’un ciseau tranchant à la base du tronc cérébral de l’animal.
- Lavez la tête de l’animal trois fois dans du GBSS froid et apportez-la dans l’enceinte de sécurité.
- Isolement tissulaire et préparation de coupes
- Insérez fermement des pinces pointues dans les orbites pour maintenir la tête.
- À l’aide d’un ciseau fin, coupez la peau/le cuir chevelu le long de la ligne médiane, en partant du foramen vertébral vers les lobes frontaux, et mettez-le de côté.
- Couper de la même manière le crâne et le long de la fissure transversale cérébrale (espace entre le cerveau et le cervelet). À l’aide d’une longue pince incurvée, écartez-le.
- Jetez les bulbes olfactifs à l’aide d’une spatule. Retirez le cerveau de la tête et placez-le dans un GBSS glacé avec la face dorsale vers le haut (Figure 1A).
- Insérez la pince fine dans le cervelet et longez la ligne médiane avec la spatule en ouvrant chaque hémisphère avec beaucoup de précaution (Figure 1B).
- À l’aide d’une pince à courbe courte, retirez soigneusement l’excès de tissu qui recouvre l’hippocampe, sans toucher la structure de l’hippocampe. Puis à l’aide d’une spatule, coupez sous chaque hippocampe (Figure 1C).
- Prenez un hémisphère et placez-le, hippocampe vers le haut, sur un papier filtre. Répétez la procédure avec l’autre hémisphère et placez-le parallèlement au premier, dans le papier filtre. Placez le papier filtre sur le hachoir à tissus, avec les hémisphères perpendiculaires à la lame, et coupez les hémisphères en tranches de 350 μm (Figure 1D).
- Placez le tissu tranché dans une boîte de Pétri avec du GBSS froid (Figure 1E).
- Séparez soigneusement les tranches à l’aide des électrodes à bout rond (Figure 1F). Ne conservez que les tranches avec un cortex rhinal et un hippocampe structurellement intacts. Les zones DG et CA doivent être parfaitement définies, ainsi que le cortex entorhinal et périrhinal (Figure 1G).
- Placez chaque tranche sur l’insert (Figure 1H-I), à l’aide d’une spatule et d’une électrode à bout rond. Retirez l’excès de milieu de dissection autour de chaque tranche à l’aide d’une pipette P20 (Figure 1J). Quatre tranches de cortex rhinal-hippocampe peuvent être cultivées dans un seul insert (Figure 1K).
- Entretien de la culture
- Changez de support tous les deux jours.
- Réchauffez le milieu à 37 °C.
- Sortez les assiettes de l’incubateur. Saisissez chaque insert en tenant le bord en plastique à l’aide d’une pince (Figure 1L).
- Utilisez une main libre pour aspirer le fluide du puits. Remettez l’insert dans le puits et ajoutez 1 ml, à l’aide d’une pipette P1000, de milieu frais réchauffé (figure 1M). Répétez l’opération pour tous les inserts. Assurez-vous qu’aucune bulle d’air n’est piégée entre la membrane et le fluide.
note: Les tranches de type épileptique subissent une privation progressive et contrôlée de sérum dans le milieu. À partir de 9 jours in vitro (DIV), les tranches sont maintenues en NBA sans HS.
2. Enregistrements électrophysiologiques
REMARQUE : Des enregistrements électrophysiologiques ont été réalisés dans des coupes organotypiques du cortex rhinal-hippocampe à 7, 14 et 21 DIV dans une chambre de type interface. Les enregistrements ont été obtenus à l’aide d’un amplificateur, numérisés et analysés à l’aide d’un logiciel. Tous les enregistrements ont été filtrés passe-bande (filtre de Bessel à huit pôles à 60 Hz et filtre gaussien à 600 Hz).
- Préparation de la configuration
- Préparez 50 ml de milieu NBA avec 1 ml de B27 et 250 μL de L-Glutamine. Réchauffez-vous à 37 °C.
- Réglez la configuration électrophysiologique en circuit fermé. Vérifiez si le débit est de 2 mL/min.
- Ouvrez la vanne de la boîte de transport (5 % CO2/95 % O2) et vérifiez le niveau d’eau dans le système.
- Placez le papier filtre dans la chambre d’enregistrement de l’interface pour drainer l’excès de fluide et le papier de nettoyage de l’objectif sous le cadre pour fournir du fluide à la tranche.
- Allumez le régulateur de température, les amplificateurs et le micromanipulateur.
- Laissez la température dans la chambre d’interface se stabiliser à 37 °C avant de commencer les enregistrements.
- Préparez du liquide céphalo-rachidien artificiel (aCSF : 124 mM NaCl, 3mM KCl, 1,2 mM NaH2PO4, 25 mM NaHCO3, 10 mM de glucose, 2 mM CaCl2, 1 mM MgSO4 avec un pH de 7,4) et utilisez-le pour remplir l’électrode en verre avec une seringue. Placez-le dans l’électrode réceptrice.
- Enregistrements de l’activité spontanée
- Une fois que la température est stable, retirez la plaque de l’incubateur et coupez une tranche de l’insert avec une lame très tranchante. Placez-le dans une plaque de 60 mm avec une goutte de moyen. Apportez-le à la chambre d’enregistrement de l’interface.
- Placez la tranche dans la chambre d’interface avec l’hippocampe en bas à droite. Placez l’électrode réceptrice dans la couche de cellule pyramidale CA3.
- Passez au protocole d’acquisition continue et enregistrez pendant 30 min.
