Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation des tranches de cortex rhinal-hippocampe
NOTE : La préparation des tranches de cortex rhinal-hippocampe utilise des rats Sprague-Dawley P6-7.
- Mise en place de la culture et préparation du milieu
- La veille de la culture, préparez le milieu requis et placez-le à 4 °C.
- Préparez le milieu de dissection : 25 mM de glucose dans la solution saline équilibrée de Gey (GBSS).
- Préparez le milieu de culture : 50 % d’Opti-MEM, 25 % de HBSS, 25 % de sérum de cheval (HS), 25 mM de glucose, 30 μg/mL de gentamycine.
- Préparez le milieu d’entretien : Neurobasal-A (NBA), 2 % B27, 1 mM de L-glutamine, 30 μg/mL de gentamicine, HS (15 %, 10 %, 5 % et 0 %).
- Prélèvement cérébral
- Juste avant de commencer la culture, ajoutez 1,1 mL de milieu de culture dans chaque puits de la plaque à 6 puits avec une pipette P1000 et placez-le à 37 °C.
- Placez tout l’équipement (microscope de dissection, hachoir à tissus, lampe de dissection, outils de dissection, électrodes, plaques, inserts et papiers-filtres) à l’intérieur de l’enceinte de sécurité biologique et stérilisez à la lumière UV pendant 15 minutes.
- Ajustez l’épaisseur de la tranche à 350 μm.
- Retirez le GBSS du réfrigérateur. Ajouter 5 ml de GBSS dans six boîtes de Pétri. Six boîtes de Pétri seront nécessaires par animal.
- Euthanasier le petit rat. Effectuez la décapitation à l’aide d’un ciseau tranchant à la base du tronc cérébral de l’animal.
- Lavez la tête de l’animal trois fois dans du GBSS froid et apportez-la dans l’enceinte de sécurité.
- Isolement tissulaire et préparation de coupes
- Insérez fermement des pinces pointues dans les orbites pour maintenir la tête.
- À l’aide d’un ciseau fin, coupez la peau/le cuir chevelu le long de la ligne médiane, en partant du foramen vertébral vers les lobes frontaux, et mettez-le de côté.
- Couper de la même manière le crâne et le long de la fissure transversale cérébrale (espace entre le cerveau et le cervelet). À l’aide d’une longue pince incurvée, écartez-le.
- Jetez les bulbes olfactifs à l’aide d’une spatule. Retirez le cerveau de la tête et placez-le dans un GBSS glacé avec la face dorsale vers le haut (Figure 1A).
- Insérez la pince fine dans le cervelet et longez la ligne médiane avec la spatule en ouvrant chaque hémisphère avec beaucoup de précaution (Figure 1B).
- À l’aide d’une pince à courbe courte, retirez soigneusement l’excès de tissu qui recouvre l’hippocampe, sans toucher la structure de l’hippocampe. Puis à l’aide d’une spatule, coupez sous chaque hippocampe (Figure 1C).
- Prenez un hémisphère et placez-le, hippocampe vers le haut, sur un papier filtre. Répétez la procédure avec l’autre hémisphère et placez-le parallèlement au premier, dans le papier filtre. Placez le papier filtre sur le hachoir à tissus, avec les hémisphères perpendiculaires à la lame, et coupez les hémisphères en tranches de 350 μm (Figure 1D).
- Placez le tissu tranché dans une boîte de Pétri avec du GBSS froid (Figure 1E).
- Séparez soigneusement les tranches à l’aide des électrodes à bout rond (Figure 1F). Ne conservez que les tranches avec un cortex rhinal et un hippocampe structurellement intacts. Les zones DG et CA doivent être parfaitement définies, ainsi que le cortex entorhinal et périrhinal (Figure 1G).
- Placez chaque tranche sur l’insert (Figure 1H-I), à l’aide d’une spatule et d’une électrode à bout rond. Retirez l’excès de milieu de dissection autour de chaque tranche à l’aide d’une pipette P20 (Figure 1J). Quatre tranches de cortex rhinal-hippocampe peuvent être cultivées dans un seul insert (Figure 1K).
- Entretien de la culture
- Changez de support tous les deux jours.
- Réchauffez le milieu à 37 °C.
- Sortez les assiettes de l’incubateur. Saisissez chaque insert en tenant le bord en plastique à l’aide d’une pince (Figure 1L).
- Utilisez une main libre pour aspirer le fluide du puits. Remettez l’insert dans le puits et ajoutez 1 ml, à l’aide d’une pipette P1000, de milieu frais réchauffé (figure 1M). Répétez l’opération pour tous les inserts. Assurez-vous qu’aucune bulle d’air n’est piégée entre la membrane et le fluide.
note: Les tranches de type épileptique subissent une privation progressive et contrôlée de sérum dans le milieu. À partir de 9 jours in vitro (DIV), les tranches sont maintenues en NBA sans HS.
2. Essai d’absorption de l’IP
REMARQUE : La mort cellulaire a été évaluée en surveillant l’absorption cellulaire de l’iodure de propidium (IP), un colorant fluorescent. L’IP est un composé polaire qui pénètre dans les cellules dont les membranes cellulaires sont endommagées et interagit avec l’ADN en émettant une fluorescence rouge (absorbance 493 nm, émission 630 nm). Étant donné que l’IP n’est pas destiné aux cellules vivantes, il est utilisé pour détecter les cellules mortes dans une population.
- Incubation PI
- Préparer, dans un milieu de culture, une dilution fraîche de 1:10 de stock de PI.
- Pour le test d’absorption de PI, retirez la plaque de l’incubateur et soulevez délicatement l’insert. Ajouter 13 μL de PI au fluide, à l’aide d’une pipette P20, en obtenant une concentration finale de 2 μM. Agiter lentement la plaque avant de remettre l’insert en place. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles sous les tranches.
- Remettez les tranches dans l’incubateur à 37 °C pendant 2 h.
- Poursuivez avec le protocole d’immunohistochimie, comme décrit dans la section suivante. Couvrez les plaques avec de l’aluminium, car PI est sensible à la lumière.
3. Immunohistochimie
REMARQUE : En immunohistochimie, un anticorps spécifique aux neurones, ainsi que des anticorps capables de discriminer les phénotypes au repos et réactifs des microglies et des astrocytes, ont été utilisés pour évaluer l’étendue de la mort neuronale et de la gliose dans des coupes organotypiques de type épileptique du cortex rhinal-hippocampe.
- Fixation tissulaire
- Retirez la plaque de l’incubateur et aspirez le fluide. Fixez les tranches avec du paraformaldéhyde à 4 % (PFA) pendant 1 h à RT, en ajoutant 1 mL de PFA sous et au-dessus des tranches, à l’aide d’une pipette P1000.
- Retirer le PFA et ajouter 1 mL de PBS. Ajoutez également du PBS en dessous et au-dessus des tranches.
- Conserver les tranches à 4 °C, dans du PBS, jusqu’à nouvel ordre. Mettez toujours du parafilm autour des plaques pour éviter le dessèchement.
- Étapes d’immunomarquage
- Laver deux fois, 10 min à chaque fois, avec 1 mL de PBS.
- Préparez une solution de perméabilisation/blocage contenant 1 % de Triton-X100, 10 % de HS et 10 % de BSA dans du PBS. Préparez une solution de BSA à 5 %.
- Dessinez deux rectangles avec le stylet hydrophobe (Figure 2A). Coupez les tranches de l’insert (Figure 2B) à l’aide d’une lame très tranchante. Placez deux tranches par lame (figure 2C) et ajoutez 140 μL de solution de perméabilisation/blocage sur le dessus de chaque tranche, à l’aide d’une pipette P200. Incubation pendant 3 h à RT.
- Diluer les anticorps primaires à la dilution de travail dans 5 % BSA dans PBS. Incuber avec les anticorps primaires pendant la nuit à 4 °C.
- Incuber avec les anticorps secondaires pendant 4 h à RT. À partir de cette étape, protégez la plaque de la lumière car des fluorophores sont travaillés avec.
- Déposer une goutte de 50 μL de solution Hoechst sur le dessus de chaque tranche et incuber pendant 20 min à RT.
- Laver entre les incubations. Lavez toujours trois fois, pendant 10 minutes à chaque fois, avec du PBS-T.
- Retirez Hoechst et lavez comme recommandé.
- Ajouter 50 μL de milieu de montage sur le dessus de chaque tranche. Recouvrez d’une lamelle en verre et entourez de vernis à ongles (figure 2D).
- Laissez sécher à RT pendant 24 h.
- Visualisez l’immunomarquage au microscope confocal. Maintenez les tranches tachées à -20 °C.
