Dosage de l’agrégation PolyQ pour identifier l’effet neuroprotecteur d’un composé chez les vers

Résumé

Source : Wang, Q. et al. Caenorhabditis elegans comme système modèle pour la découverte de composés bioactifs contre la neurotoxicité médiée par la polyglutamine. J. Vis. Exp. (2021)

Cette vidéo décrit une méthode in vivo pour dépister le potentiel protecteur des composés neuroprotecteurs des essais dans la réduction de l’agrégation polyQ dans les cellules musculaires de la paroi corporelle des nématodes et l’amélioration de la protéotoxicité associée à l’agrégation.

Protocole

1. Test d’agrégation PolyQ

1. Préparation de nématodes pour l’essai d’agrégation polyQ
   1. Transférer 300 à 500 larves synchronisées L1 d’AM141 dans chaque puits d’une plaque de 48 puits avec 500 μL de milieu S contenant OP50 (DO₅₇₀ de 0,7-0,8) et 5 mg/mL d’astragalane, généralement un puits par traitement pendant un point temporel.
   2. Scellez la plaque avec du parafilm et incubez à 20 °C et 120 tr/min pendant 24, 48, 72 et 96 h.
   3. Récoltez les nématodes dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,5 mL et lavez-les avec le tampon M9 >3 fois par centrifugation (1000 × g pendant 1 min) pour éliminer l’OP50 restant. Remettez les nématodes AM141 en suspension dans la mémoire tampon M9 et maintenez-les prêts pour l’acquisition d’images.
2. Acquisition d’images fluorescentes et analyse de données
   REMARQUE : Les données sont automatiquement analysées avec ce système d’imagerie à haut contenu. S’il n’existe pas de dispositif d’imagerie automatisé, une méthode conventionnelle de préparation d’un tampon d’agarose pour l’acquisition d’images peut être utilisée pour obtenir des performances similaires en utilisant un microscope fluorescent courant.
   1. Transvasez 10 à 15 nématodes dans chaque puits dans une plaque de 384 puits (volume final de 80 μL par puits). Réglez 10 puits répétés pour chaque traitement.
   2. Ajouter 10 μL de 200 mM d’azoture de sodium dans chaque puits pour paralyser les nématodes et les laisser se déposer au fond (5-10 min).
   3. Placez la plaque dans un système d’imagerie à haut contenu pour acquérir des images fluorescentes (voir le Tableau des matériaux pour plus d’informations sur le dispositif et le logiciel).
   4. Ouvrez le logiciel d’acquisition d’images et configurez les paramètres suivants.
      1. Ouvrez la fenêtre Configuration de l’acquisition de plaques et créez un ensemble d’expériences et un nom.
      2. Sélectionnez Agrandissement 2x, Binning de l’appareil photo 1 et Type de plaque Plaque 384 puits.
      3. Définissez les puits et les sites (site unique) à visiter.
      4. Sélectionnez le filtre isothiocyanate de fluorescéine (FITC) et activez les options de mise au point basées sur l’image.
      5. Réglez l’exposition sur 300 ms.
         note: Les paramètres ci-dessus peuvent être testés et ajustés pour optimiser les paramètres d’imagerie.
      6. Enregistrez les paramètres d’acquisition d’images et cliquez sur le bouton Acquérir la plaque pour exécuter.
   5. Analysez les données d’image à l’aide du logiciel d’analyse d’image.
      1. Ouvrez la fenêtre Données de la plaque d’examen et sélectionnez la plaque d’essai pour l’analyse d’image.
      2. Double-cliquez sur un puits de test pour afficher son image.
      3. Sélectionnez l’option Compter les noyaux comme méthode d’analyse et cliquez sur le bouton Configurer les paramètres pour afficher une fenêtre pour les paramètres suivants.
      4. Définissez l’image source à partir du canal FITC et sélectionnez l’algorithme standard.
      5. Réglez les paramètres d’analyse d’image comme suit : largeur minimale approximative = 10 μm (= 2 pixels) ; largeur maximale approximative = 50 μm (= 12 pixels) ; intensité au-dessus du fond local = 1 000-2 000 niveaux de gris.
      6. Testez les paramètres actuels pour optimiser la méthode d’analyse.
      7. Enregistrez les paramètres et lancez l’analyse sur tous les wells.
         note: Il faut ~20 min pour terminer l’analyse d’une plaque de 384 puits.
      8. Exportez le nombre total de noyaux sous forme de nombre total d’agrégats Q40 ::YFP dans chaque puits.
   6. Comptez le nombre de nématodes dans chaque puits.
   7. Calculez le nombre moyen d’agrégats Q40 ::YFP par nématode dans chaque groupe et appliquez un ajustement de courbe non linéaire aux données de chaque point temporel.
   8. Calculer l’indice d’inhibition :
      Indice d’inhibition = (_{N témoin} - N_échantillon) / Ncontrol
      Où N_témoin et N_échantillon sont le nombre moyen d’agrégats Q40 ::YFP dans les groupes témoin et traitement, respectivement.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Souche de C. elegans
AM141 rmIs133 [unc-54p ::Q40 ::YFP]	Centre de Génétique Caenorhabditis (CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/AM141
souche E. coli
OP50	Centre de Génétique Caenorhabditis (CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/OP50
Réactif
Azoture de sodium	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	80115560	https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af 551E96FF5F07CD
équipement
Plaque de culture cellulaire à 384 puits	Nest Biotechnology Co., Ltd.	761001	https://www.cell-nest.com/page94 ? _l=fr&product_id=85
Plaque de culture cellulaire à 48 puits	Nest Biotechnology Co., Ltd.	748001	https://www.cell-nest.com/page94 ? _l=fr&product_id=85
Microscope à fluorescence	Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd.	Mshot MF31-LED	https://www.mshot.com/ article/442.html
Système d’imagerie à haut contenu	Dispositifs moléculaires	ImageXpress	https://www.moleculardevices.com/ produits/Systèmes-d’imagerie-cellulaire#Imagerie-à-haut contenu
Microcentrifugeuse	GeneCompany	GENESPEED X1	https://www.genecompany.com/ index.php/Accueil/Biens/ goodsdetails/gid/189.html
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793-1EA	https://www.sigmaaldrich.cn/CN/en/product/sigma/p7793?context=product
Appareil photo numérique microscope	Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd.	MS60	https://www.mshot.com/article/677.html
logiciel
Logiciel d’acquisition et d’analyse d’images	Dispositifs moléculaires	MetaXpress	https://www.moleculardevices.com/ produits/Systèmes-d’imagerie-cellulaire/Logiciels-d’acquisition et d’analyse/ Metaxpress