Un essai pour étudier l’effet d’un composé testé contre la neurotoxicité médiée par PolyQ chez les vers

Résumé

Source : Wang, Q. et al., Caenorhabditis elegans as a Model System for Discovering Bioactive Compounds Against Polyglutamine-Mediated Neurotoxicity. J. Vis. Exp. (2021)

Dans cette vidéo, nous décrivons une méthode pour évaluer l’effet neuroprotecteur d’un composé testé, l’astragalane, sur la survie neuronale chez Caenorhabditis elegans à partir de la neurotoxicité médiée par polyQ. Le test utilise Caenorhabditis elegans exprimant les répétitions polyQ anormalement expansées fusionnées à la GFP dans leurs neurones ASH pour mesurer la survie neuronale après le traitement par composé testé.

Protocole

1. Essai de neurotoxicité médié par PolyQ

1. Traitement de C. elegans avec des échantillons d’essai
   1. Pour préparer les nématodes à l’essai de neurotoxicité polyQ, transférez 300 à 500 larves synchronisées L1 de HA759 dans chaque puits d’une plaque de 48 puits avec 500 μL de milieu S contenant OP50 (DO₅₇₀ de 0,7 à 0,8) et 5 mg/mL d’astragalane ; généralement trois puits de répétition pour chaque traitement.
   2. Scellez la plaque avec du parafilm et incubez à 15 °C et 120 tr/min pendant 3 jours.
   3. Collectez les nématodes par centrifugation et lavez-les 3 à 5 fois avec un tampon M9. Remettre les nématodes en suspension dans le tampon M9 pour les utiliser dans des tests de survie et d’évitement neuronaux.
2. Préparation du tampon d’agarose
   1. Ajouter 2 g d’agarose à 100 mL de tampon M9 (2 %, p/v) et chauffer la solution d’agarose au micro-ondes jusqu’à ce qu’elle soit presque à ébullition.
   2. Versez 0,5 mL d’agarose fondu au centre d’une lame de verre de microscopie de 1 mm d’épaisseur placée entre deux morceaux de plaques de verre de 2 mm d’épaisseur. Couvrir avec une autre diapositive verticalement. Une fois que l’agarose refroidit et est solidifiée, retirez délicatement la lame supérieure.
3. Test de survie neuronale ASH
   1. Ajouter une goutte de 20 mM d’azoture de sodium sur le tampon d’agarose. Transférez 15 à 20 nématodes HA759 dans la goutte pour les immobiliser.
   2. Placez doucement une lamelle sur les nématodes. Conservez la lame sous un microscope à fluorescence équipé d’un appareil photo numérique. Sélectionnez une lentille d’objectif 40x et un filtre FITC pour détecter les neurones ASH positifs à la GFP dans la région de la tête des nématodes.
   3. Sélectionnez au hasard plus de 50 nématodes dans chaque groupe pour compter le nombre de nématodes avec des neurones ASH bilatéraux marqués à la GFP dans leur région de la tête. Calculer le taux de survie des neurones ASH :
      Survie neuronale ( %) =
      Où N_survie et N_total sont le nombre de nématodes avec des neurones ASH positifs à la GFP et le nombre total de nématodes testés dans chaque groupe, respectivement.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Souche de C. elegans
HA759 rtIs11 [osm-10p ::GFP + osm-10p ::HtnQ150 + dpy-20(+)]	Centre de Génétique Caenorhabditis (CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/HA759
souche E. coli
OP50	Centre de Génétique Caenorhabditis (CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/OP50
Réactif
Agarose	Biowest	Référence 111860
Azoture de sodium	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	80115560	https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af 551E96FF5F07CD
équipement
Plaque de culture cellulaire à 48 puits	Nest Biotechnology Co., Ltd.	748001	https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85
Microscope à fluorescence	Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd.	Mshot MF31-LED	https://www.mshot.com/article/442.html
Système d’imagerie à haut contenu	Dispositifs moléculaires	ImageXpress Pico	https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems#High-Content-Imaging
Microcentrifugeuse	GeneCompany	GENESPEED X1	https://www.genecompany.com/index.php/Home/Goods/goodsdetails/gid/189.html
Appareil photo numérique microscope	Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd.	MS60	https://www.mshot.com/article/677.html
micro-ondes	Midea Corp.	M1-211A	https://www.midea.cn/10000/10000000001
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793-1EA	https://www.sigmaaldrich.cn/CN/en/product/sigma/p7793?context=product
logiciel
Logiciel d’acquisition et d’analyse d’images	Dispositifs moléculaires	MetaXpress	https://www.moleculardevices.com/ produits/Systèmes-d’imagerie-cellulaire/Logiciels-d’acquisition et d’analyse/ Metaxpress