Examiner le comportement de la chimioévitance chez les vers transgéniques à l’aide d’un test d’évitement osmotique

Abstract

Source : Wang, Q. et al., Z. Caenorhabditis elegans as a Model System for Discovering Bioactive Compounds Against Polyglutamine-Mediated Neurotoxicity. J. Vis. Exp. (2021).

Cette vidéo décrit un test d’évitement osmotique pour examiner le comportement de chimioévitement dans un modèle de ver transgénique. Le comportement d’évitement est testé dans une plaque en présence d’une barrière osmotique élevée et d’un chimioattractant. Les vers avec une perte fonctionnelle de neurones sont attirés par le chimioattractant, traversent la barrière osmotique élevée et deviennent paralysés dans la zone de piégeage à cause de la solution anesthésique.

Protocol

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

REMARQUE : Voir le Tableau 1 pour les recettes des solutions utilisées dans ce protocole.

1. Préparation des matériaux pour le dosage de Caenorhabditis elegans

1. Maintien des souches de C. elegans
   1. Obtenir les souches de C. elegans (AM141 et HA759) et d’Escherichia coli (OP50 et NA22) (voir le tableau des matières).
   2. Maintenir les nématodes sur la plaque de milieu de croissance des nématodes (NGM) ensemencée avec E. coli OP50 à 20 °C pour AM141 ou à 15 °C pour HA759.
2. Préparation de la culture bactérienne d’E. coli OP50
   1. Prélever une seule colonie d’E. coli OP50 dans une plaque de stries Luria-Bertani (LB) et l’inoculer dans 50 mL de culture liquide LB.
   2. Incuber la bactérie OP50 dans un agitateur à 37 °C et 200 tr/min jusqu’à une densité optique de ~0,5 à 570 nm (OD₅₇₀).
   3. Conservez la culture bactérienne OP50 à 4 °C et utilisez-la dans les deux semaines.
3. Préparation de plaques NGM avec la bactérie OP50
   1. Ajoutez 20 g d’agar-agar, 2,5 g de peptone, 3,0 g de NaCl et 975 ml d’eau désionisée dans une bouteille autoclavable de 1 L. Autoclave à 121 °C pendant 30 min.
   2. Placez le flacon de gélose NGM liquide sur la paillasse pour qu’il refroidisse à ~60 °C, puis ajoutez les solutions mères stériles suivantes : 1 mL de 1 M de CaCl₂, 1 mL de 1 M de MgSO₄, 1 mL de 5 mg/mL de cholestérol et 25 mL de phosphate de potassium 1 M (pH 6,0).
   3. Versez 20 ml de NGM dans une boîte de Pétri stérile de 90 mm et laissez les plaques refroidir et solidifier sur la paillasse. Gardez les assiettes à l’envers et laissez-les sécher sur le banc à température ambiante pendant 2 jours.
   4. Versez 200 μL de la culture bactérienne OP50 sur chaque plaque NGM et étalez-la uniformément avec une tige de revêtement en verre stérile. Fermez les couvercles et incubez les plaques pendant une nuit à 37 °C.
   5. Conservez les plaques NGM ensemencées avec OP50 dans une boîte en plastique avec un couvercle à température ambiante et utilisez-les dans les deux semaines.
4. Préparation d’une population de C. elegans synchronisée selon l’âge
   1. Prélever les nématodes adultes gravides dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,5 mL et centrifuger à 1000 × g pendant 1 min. Laver trois fois et remettre les nématodes en suspension dans le tampon M9.
   2. Ajoutez un volume égal de solution d’eau de Javel et agitez doucement pendant 3 à 5 min. Surveillez le blanchiment toutes les 15 s à l’aide d’un microscope à dissection.
      note: La solution d’eau de Javel doit être préparée fraîchement avant utilisation en mélangeant des volumes égaux de 10 % de NaOCl et de 1 M de NaOH (tableau 1).
   3. Une fois que la plupart des nématodes sont cassés, arrêtez la digestion en diluant avec un tampon M9. Centrifugez rapidement pour éliminer le surnageant et remettez la pastille en suspension dans le tampon M9 pour répéter le lavage trois fois.
   4. Remettre le granulé en suspension dans le milieu S. Laissez les résidus de nématodes se déposer par gravité pendant 2-3 minutes pendant que les œufs restent dans le surnageant.
   5. Aspirez le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation stérile. Recueillir les œufs par centrifugation à 1000 × g pendant 1 min.
   6. Jeter ~80 % du surnageant et transférer les œufs dans une fiole stérile contenant 20 mL de milieu S. Placez le ballon dans un shaker et incubez les œufs toute la nuit sans nourriture à 120 tr/min pour obtenir des nématodes L1 synchronisés.

2. Essais de neurotoxicité médiés par PolyQ

1. Traitement de C. elegans avec des échantillons d’essai
   1. Pour préparer les nématodes à l’essai de neurotoxicité polyQ, transférez 300 à 500 larves synchronisées L1 de HA759 dans chaque puits d’une plaque de 48 puits avec 500 μL de milieu S contenant OP50 (OD570 de 0,7-0,8) et 5 mg/mL d’astragalane, généralement trois puits de répétition pour chaque traitement.
   2. Scellez la plaque avec du parafilm et incubez à 15 °C et 120 tr/min pendant 3 jours.
   3. Collectez les nématodes par centrifugation et lavez-les 3 à 5 fois avec un tampon M9. Remettre les nématodes en suspension dans le tampon M9 pour les utiliser dans des tests de survie et d’évitement neuronaux.
2. Dosage d’évitement osmotique
   1. Divisez une plaque NGM sans aliments (9 cm) en zones normales (N) et trappez (T) par une ligne de glycérol 8 M (~30 μL) au milieu. Étalez une ligne d’azoture de sodium de 200 mM (~20 μL) à ~1 cm de la ligne de glycérol pour paralyser les nématodes qui traversent la barrière glycérique dans la zone T.
   2. Transférez ~200 nématodes chacun sur la zone N de trois plaques répétées pour chaque groupe. Ajouter une goutte de butanedione à 1 % (~2 μL) sur la zone T (à 1 cm du bord de la plaque) pour attirer les nématodes. Couvrez immédiatement le couvercle de la boîte de Pétri et laissez incuber à 23 °C pendant 90 min.
   3. Noter au microscope le nombre de nématodes sur les zones N et T. Calculer l’indice d’évitement à l’aide de eq.
      Indice d’évitement = N / (T + N)
      Où N et T sont le nombre de nématodes dans les zones N et T, respectivement. Les données sont présentées sous forme de moyennes ±écart-type (ET) de trois répétitions, représentatives de >3 expériences indépendantes.
   4. Effectuez un test t bilatéral non apparié pour comparer les données des groupes astragale et témoin.

Tableau 1 :

solution	Instructions de préparation	stockage
1 M CaCl2	111 g de CaCl2	Conserver à température ambiante (RT)
	Ajouter dH2O à 1 L
	autoclave
1 M Phosphate de potassium (pH 6,0)	108,3 g KH2PO4	Magasin chez RT
	35,6 K2HPO4
	Ajouter dH2O à 1 L
	autoclave
1 M MgSO4	246 g de MgSO4·7H2O	Magasin chez RT
	Ajouter dH2O à 1 L
	autoclave
Cholestérol dans l’éthanol (5 mg/mL)	0,5 g de cholestérol	Stocker à -20 °C
	Ajouter de l’éthanol à 100 mL
	Ne pas autoclaver !
1 M Citrate de potassium (pH 6,0)	Ajouter 10,0 g d’acide citrique monohydraté	Magasin chez RT
	Ajouter 146,75 g d’acide citrique tripotassique monohydraté
	Ajouter dH2O à 1 L
	autoclave
Solution de métaux traces	0,93 g EDTA disodique	Stocker dans l’obscurité sur RT
	0,345 g FeSO4·7H2O
	0,1 g MnCl2·4H2O
	0,145 g de ZnSO4·7H2O
	Ajouter 0,0125 g CuSO4·5H2O
	Ajouter du dH2O à 500 mL
	autoclave
1 M NaOH	4 g de NaOH	Magasin chez RT
	Ajouter du dH2O à 100 mL
Solution d’eau de Javel	0,5 mL de NaOH 1 M	Préparer fraîchement avant utilisation
	0,5 mL de NaOCl à 10 %
M9 tampon	5 g de NaCl	Magasin chez RT
	3 g KH2PO4
	6 g Na2HPO4
	Ajouter dH2O à 1 L
	autoclave
	Ajouter 1 mL de 1 M de MgSO4
S basal	5,85 g de NaCl	Magasin chez RT
	6,0 g KH2PO4
	1,0 g K2HPO4
	Ajouter du dH2O à 973 mL
	Autoclave et refroidissement à ~60 °C
	Ajouter 1 mL de 5 mg/mL de cholestérol dans de l’éthanol
S moyen	S basal	Magasin chez RT
	Ajouter 3 ml de 1 M CaCl2
	Ajouter 3 mL de 1 M MgSO4
	Ajouter 10 ml de citrate de potassium 1 M
	Ajouter 10 mL de solution de métaux traces
	Tous les composants ont été autoclavés, ne pas autoclaver
5 mg/mL d’astragalane	0,1 g d’astragale	Stocker dans des aliquotes à -80 °C
	Ajouter 20 mL de S medium
	Filtre à travers un filtre à seringue de 0,22 μm
200 mM d’azoture de sodium	1,3 g NaN3	Stocker à 4 °C
	Ajouter 100 mL de S medium
8 M Glycérol	73,67 g de glycérol	Magasin chez RT
	Ajouter du dH2O à 100 mL
10 % bouillon de butanedione	Mélanger 10 μL de butanedione avec 90 μL de dH2O	Magasin chez RT
1 % de butanedione	Ajouter 10 μL de butanedione à 90 μL de dH2O	Magasin chez RT
1 L de culture Luria-Bertani (LB)	10 g de NaCl	Magasin chez RT
	10 g de tryptone
	5 g d’extrait de levure
	Ajouter dH2O à 1 L
	autoclave

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
souches de C. elegans
HA759 rtIs11 [osm-10p ::GFP + osm-10p ::HtnQ150 + dpy-20(+)]	Centre de Génétique Caenorhabditis (CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/HA759
souches d’E. coli
NA22	Centre de Génétique Caenorhabditis (CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/NA22
OP50	Centre de Génétique Caenorhabditis (CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/OP50
Réactif
agar-agar	Shanghai EKEAR Bio-Technology Co., Ltd.	EQ1001-500G	https://www.ekear.com
Butanedione	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	80042427	https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/d027c00e64c9404d9aa41391fbb Référence 595d0
cholestérol	Sigma-Aldrich	Réf. C8667	https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh/product/sigma/c8667?context=product
glycérol	Aladdin Co., Ltd.	G116203	https://www.aladdin-e.com/zh_cn/g116203.html
Peptone	Guangdong HuanKai Microbial Science and Technology Co., Ltd.	Référence 050170B	https://www.huankai.com/show/21074.html
Azoture de sodium	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	80115560	https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af 551E96FF5F07CD
hydroxyde de sodium	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10019718	https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/450dfdb1132a4d8a817 D3D8C68EC25E6
Solution d’hypochlorite de sodium	Usine de réactifs chimiques de Guangzhou	Référence 7681-52-9	http://www.chemicalreagent.com/product/DetailProduct.aspx?id=125
Tryptone	Oxoid Ltée	LP0042B	https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0042B#/LP0042B
Extrait de levure	Oxoid Ltée	LP0021B	https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0021B#/LP0021B
équipement
Plaque de culture cellulaire à 48 puits	Nest Biotechnology Co., Ltd.	748001	https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85
Boîte de Pétri de 90 mm	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	F611003	https://www.sangon.com/productDetail?productInfo.code=F611003
autoclave	Panasonic	MLS-3781L-PC
Microscope de dissection	ChongQing Optical Co., Ltd.	ZSA0745	http://www.coicuop.com/plus/view.php?aid=64
Microcentrifugeuse	GeneCompany	GENESPEED X1	https://www.genecompany.com/index.php/Home/Goods/goodsdetails/gid/189.html
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793-1EA	https://www.sigmaaldrich.cn/CN/en/product/sigma/p7793?context=product
secoueur	Zhicheng Inc.	ZWY-2102C	http://www.zhicheng.net/Product/0865291356.html