Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
REMARQUE : Voir le Tableau 1 pour les recettes des solutions utilisées dans ce protocole.
1. Préparation des matériaux pour le dosage de Caenorhabditis elegans
- Maintien des souches de C. elegans
- Obtenir les souches de C. elegans (AM141 et HA759) et d’Escherichia coli (OP50 et NA22) (voir le tableau des matières).
- Maintenir les nématodes sur la plaque de milieu de croissance des nématodes (NGM) ensemencée avec E. coli OP50 à 20 °C pour AM141 ou à 15 °C pour HA759.
- Préparation de la culture bactérienne d’E. coli OP50
- Prélever une seule colonie d’E. coli OP50 dans une plaque de stries Luria-Bertani (LB) et l’inoculer dans 50 mL de culture liquide LB.
- Incuber la bactérie OP50 dans un agitateur à 37 °C et 200 tr/min jusqu’à une densité optique de ~0,5 à 570 nm (OD570).
- Conservez la culture bactérienne OP50 à 4 °C et utilisez-la dans les deux semaines.
- Préparation de plaques NGM avec la bactérie OP50
- Ajoutez 20 g d’agar-agar, 2,5 g de peptone, 3,0 g de NaCl et 975 ml d’eau désionisée dans une bouteille autoclavable de 1 L. Autoclave à 121 °C pendant 30 min.
- Placez le flacon de gélose NGM liquide sur la paillasse pour qu’il refroidisse à ~60 °C, puis ajoutez les solutions mères stériles suivantes : 1 mL de 1 M de CaCl2, 1 mL de 1 M de MgSO4, 1 mL de 5 mg/mL de cholestérol et 25 mL de phosphate de potassium 1 M (pH 6,0).
- Versez 20 ml de NGM dans une boîte de Pétri stérile de 90 mm et laissez les plaques refroidir et solidifier sur la paillasse. Gardez les assiettes à l’envers et laissez-les sécher sur le banc à température ambiante pendant 2 jours.
- Versez 200 μL de la culture bactérienne OP50 sur chaque plaque NGM et étalez-la uniformément avec une tige de revêtement en verre stérile. Fermez les couvercles et incubez les plaques pendant une nuit à 37 °C.
- Conservez les plaques NGM ensemencées avec OP50 dans une boîte en plastique avec un couvercle à température ambiante et utilisez-les dans les deux semaines.
- Préparation d’une population de C. elegans synchronisée selon l’âge
- Prélever les nématodes adultes gravides dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,5 mL et centrifuger à 1000 × g pendant 1 min. Laver trois fois et remettre les nématodes en suspension dans le tampon M9.
- Ajoutez un volume égal de solution d’eau de Javel et agitez doucement pendant 3 à 5 min. Surveillez le blanchiment toutes les 15 s à l’aide d’un microscope à dissection.
note: La solution d’eau de Javel doit être préparée fraîchement avant utilisation en mélangeant des volumes égaux de 10 % de NaOCl et de 1 M de NaOH (tableau 1).
- Une fois que la plupart des nématodes sont cassés, arrêtez la digestion en diluant avec un tampon M9. Centrifugez rapidement pour éliminer le surnageant et remettez la pastille en suspension dans le tampon M9 pour répéter le lavage trois fois.
- Remettre le granulé en suspension dans le milieu S. Laissez les résidus de nématodes se déposer par gravité pendant 2-3 minutes pendant que les œufs restent dans le surnageant.
- Aspirez le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation stérile. Recueillir les œufs par centrifugation à 1000 × g pendant 1 min.
- Jeter ~80 % du surnageant et transférer les œufs dans une fiole stérile contenant 20 mL de milieu S. Placez le ballon dans un shaker et incubez les œufs toute la nuit sans nourriture à 120 tr/min pour obtenir des nématodes L1 synchronisés.
2. Essais de neurotoxicité médiés par PolyQ
- Traitement de C. elegans avec des échantillons d’essai
- Pour préparer les nématodes à l’essai de neurotoxicité polyQ, transférez 300 à 500 larves synchronisées L1 de HA759 dans chaque puits d’une plaque de 48 puits avec 500 μL de milieu S contenant OP50 (OD570 de 0,7-0,8) et 5 mg/mL d’astragalane, généralement trois puits de répétition pour chaque traitement.
- Scellez la plaque avec du parafilm et incubez à 15 °C et 120 tr/min pendant 3 jours.
- Collectez les nématodes par centrifugation et lavez-les 3 à 5 fois avec un tampon M9. Remettre les nématodes en suspension dans le tampon M9 pour les utiliser dans des tests de survie et d’évitement neuronaux.
- Dosage d’évitement osmotique
- Divisez une plaque NGM sans aliments (9 cm) en zones normales (N) et trappez (T) par une ligne de glycérol 8 M (~30 μL) au milieu. Étalez une ligne d’azoture de sodium de 200 mM (~20 μL) à ~1 cm de la ligne de glycérol pour paralyser les nématodes qui traversent la barrière glycérique dans la zone T.
- Transférez ~200 nématodes chacun sur la zone N de trois plaques répétées pour chaque groupe. Ajouter une goutte de butanedione à 1 % (~2 μL) sur la zone T (à 1 cm du bord de la plaque) pour attirer les nématodes. Couvrez immédiatement le couvercle de la boîte de Pétri et laissez incuber à 23 °C pendant 90 min.
- Noter au microscope le nombre de nématodes sur les zones N et T. Calculer l’indice d’évitement à l’aide de eq.
Indice d’évitement = N / (T + N)
Où N et T sont le nombre de nématodes dans les zones N et T, respectivement. Les données sont présentées sous forme de moyennes ±écart-type (ET) de trois répétitions, représentatives de >3 expériences indépendantes.
- Effectuez un test t bilatéral non apparié pour comparer les données des groupes astragale et témoin.
Tableau 1 :
| solution | Instructions de préparation | stockage |
| 1 M CaCl2 | 111 g de CaCl2 | Conserver à température ambiante (RT) |
| Ajouter dH2O à 1 L |
| autoclave |
| 1 M Phosphate de potassium (pH 6,0) | 108,3 g KH2PO4 | Magasin chez RT |
| 35,6 K2HPO4 |
| Ajouter dH2O à 1 L |
| autoclave |
| 1 M MgSO4 | 246 g de MgSO4·7H2O | Magasin chez RT |
| Ajouter dH2O à 1 L |
| autoclave |
| Cholestérol dans l’éthanol (5 mg/mL) | 0,5 g de cholestérol | Stocker à -20 °C |
| Ajouter de l’éthanol à 100 mL |
| Ne pas autoclaver ! |
| 1 M Citrate de potassium (pH 6,0) | Ajouter 10,0 g d’acide citrique monohydraté | Magasin chez RT |
| Ajouter 146,75 g d’acide citrique tripotassique monohydraté |
| Ajouter dH2O à 1 L |
| autoclave |
| Solution de métaux traces | 0,93 g EDTA disodique | Stocker dans l’obscurité sur RT |
| 0,345 g FeSO4·7H2O |
| 0,1 g MnCl2·4H2O |
| 0,145 g de ZnSO4·7H2O |
| Ajouter 0,0125 g CuSO4·5H2O |
| Ajouter du dH2O à 500 mL |
| autoclave |
| 1 M NaOH | 4 g de NaOH | Magasin chez RT |
| Ajouter du dH2O à 100 mL |
| Solution d’eau de Javel | 0,5 mL de NaOH 1 M | Préparer fraîchement avant utilisation |
| 0,5 mL de NaOCl à 10 % |
| M9 tampon | 5 g de NaCl | Magasin chez RT |
| 3 g KH2PO4 |
| 6 g Na2HPO4 |
| Ajouter dH2O à 1 L |
| autoclave |
| Ajouter 1 mL de 1 M de MgSO4 |
| S basal | 5,85 g de NaCl | Magasin chez RT |
| 6,0 g KH2PO4 |
| 1,0 g K2HPO4 |
| Ajouter du dH2O à 973 mL |
| Autoclave et refroidissement à ~60 °C |
| Ajouter 1 mL de 5 mg/mL de cholestérol dans de l’éthanol |
| S moyen | S basal | Magasin chez RT |
| Ajouter 3 ml de 1 M CaCl2 |
| Ajouter 3 mL de 1 M MgSO4 |
| Ajouter 10 ml de citrate de potassium 1 M |
| Ajouter 10 mL de solution de métaux traces |
| Tous les composants ont été autoclavés, ne pas autoclaver |
| 5 mg/mL d’astragalane | 0,1 g d’astragale | Stocker dans des aliquotes à -80 °C |
| Ajouter 20 mL de S medium |
| Filtre à travers un filtre à seringue de 0,22 μm |
| 200 mM d’azoture de sodium | 1,3 g NaN3 | Stocker à 4 °C |
| Ajouter 100 mL de S medium |
| 8 M Glycérol | 73,67 g de glycérol | Magasin chez RT |
| Ajouter du dH2O à 100 mL |
| 10 % bouillon de butanedione | Mélanger 10 μL de butanedione avec 90 μL de dH2O | Magasin chez RT |
| 1 % de butanedione | Ajouter 10 μL de butanedione à 90 μL de dH2O | Magasin chez RT |
| 1 L de culture Luria-Bertani (LB) | 10 g de NaCl | Magasin chez RT |
| 10 g de tryptone |
| 5 g d’extrait de levure |
| Ajouter dH2O à 1 L |
| autoclave |
