Dosage des plaies pour évaluer la capacité migratoire des myoblastes murins en co-culture

Résumé

Source : Toubat, O. et al., Modeling Paracrine Noncanonical Wnt Signaling In Vitro. J. Vis. Exp. (2021).

Cette vidéo décrit un test de cicatrisation des plaies en co-culture sans contact pour évaluer la capacité migratoire des myoblastes murins. Cela aide à comprendre les composantes d’envoi et de réception du signal des interactions de signalisation Wnt paracrine non canoniques in vitro.

Protocole

1. Dosage des plaies :

(La figure 1 présente le modèle schématique du test)

1. Laissez les inserts de cellules O9-1 et les puits de la chambre cellulaire C2C12 adhérer et proliférer dans l’incubateur jusqu’à ce que les deux cellules soient à ~70-80 % de confluence avant de procéder à cette partie du protocole. Si les cellules se développent à > 90 % confluentes, ne procédez pas au test de grattage, car les cellules se détacheront simplement du puits.
2. Réchauffez 1x PBS et C2C12 medium en les plaçant dans un bain-marie à 37 °C.
3. Retirez bien le milieu surnageant de la chambre C2C12 et lavez les cellules une fois avec 1x PBS. Retirez le 1x PBS et grattez immédiatement les cellules avec une pointe de pipette P10 stérile.
   1. Passez fermement la pointe stérile de la pipette P10 dans une seule direction pour couvrir toute la longueur ou la largeur de la monocouche cellulaire (par exemple, de droite à gauche, de haut en bas). Assurez-vous de ne gratter qu’une seule fois chaque puits contenant des cellules.
      note: Pour optimiser les résultats de grattage, grattez des puits de différentes conditions expérimentales à un niveau de confluence similaire. Pour ce faire, assurez-vous que chaque puits à 4 chambres a des cellules pour chaque condition expérimentale requise (par exemple, le puits #1 contrôle négatif, le puits #2 contrôle positif). De plus, utilisez une nouvelle pipette P10 stérile pour chaque égratignure et appliquez une force similaire à la pipette à chaque fois. N’essayez pas de créer plus d’une égratignure dans chaque puits.
   2. Après avoir gratté, ajoutez rapidement 1 ml de 1x PBS dans le puits à l’aide d’une pointe de pipette P1000. Répétez ce processus pour chaque puits qui sera gratté.
      note: Étant donné la variabilité associée à chaque égratignure, il est recommandé d’utiliser plusieurs puits (n = 3) pour la création de la plaie dans chaque condition expérimentale. Travaillez rapidement car il est essentiel de minimiser la durée pendant laquelle les cellules sont sans PBS 1x pendant ces étapes. Après avoir retiré 1x PBS de chaque puits, il ne faut pas prendre plus de 5 s pour générer une blessure dans chaque puits.
4. Après avoir généré une plaie et ajouté 1x PBS dans chaque puits, imagez l’égratignure à l’aide d’un microscope inversé à fond clair et utilisez cette image comme taille de base de la plaie (temps 0). Pour prendre des images, effectuez les opérations suivantes :
   1. Allumez l’ordinateur et le microscope (voir le tableau des matériaux) en appuyant sur le bouton d’alimentation. Placez la glissière de chambre sur la platine et tournez le cadran de l’objectif à un grossissement de 5x.
   2. Ouvrez le logiciel d’imagerie (voir la table des matériaux) en double-cliquant sur l’icône du logiciel sur le bureau de l’ordinateur. Cliquez sur l’onglet Appareil photo sur l’écran d’accueil du logiciel. Cliquez sur le bouton Live pour visualiser les cellules dans l’onglet AxioCam IC.
   3. Assurez-vous que le filtre de lumière est tiré à fond pour permettre à la lumière de passer vers l’appareil photo et l’écran de l’ordinateur. Déplacez et/ou tournez manuellement la glissière de la chambre pour positionner la zone de la plaie au centre de l’image en direct sur l’onglet AxioCam IC.
   4. Pour prendre des images, cliquez sur Snap pour ouvrir un nouvel onglet à côté de l’onglet AxioCam IC qui contient l’image.
   5. Pour enregistrer cette image fixe, cliquez sur fichier en haut à gauche de la page d’accueil du logiciel | enregistrer sous | entrez le nom du fichier dans la zone Nom du fichier. Enregistrez la figure au format d’image Carl Zeiss (*.czi) (paramètre par défaut) et sélectionnez bureau dans la barre de gauche pour enregistrer le fichier sur le bureau en tant que fichier .czi, qui ne peut être ouvert que dans le logiciel Zen lite 2012.
   6. Pour enregistrer l’image en tant que .tiff, cliquez sur fichier | enregistrer sous | entrez le nom du fichier dans la zone du nom de fichier. Enregistrez la figure en tant que fichier image balisé (*.tiff) en cliquant sur le bouton Enregistrer sous type et en sélectionnant *.tiff dans le menu déroulant.
      note: Le format .tiff peut être ouvert dans n’importe quel logiciel de traitement d’image.
   7. Repositionnez manuellement la lame de la chambre pour prendre 2-3 images supplémentaires à d’autres points de la plaie dans le même puits.
      note: Au total, cela se traduira par 3 à 4 images non superposées et à fort grossissement de la plaie dans chaque puits.
5. Retirer 1x PBS de chaque puits et ajouter 1 mL de C2C12 medium.
   note: Veillez à ne pas pipeter de manière trop agressive lorsque vous retirez ou ajoutez des solutions dans le puits de la chambre après la génération de la plaie, car cela pourrait provoquer le détachement des cellules du puits de la chambre. De plus, inclinez bien la chambre de manière à ce que l’aspiration et la réintroduction des solutions puissent être effectuées aux coins de chaque puits afin de minimiser la rupture de la monocouche cellulaire.
6. Assemblez le système de coculture en plaçant manuellement les inserts contenant les cellules O9-1 dans chaque puits du puits de la chambre. Poussez doucement les inserts vers le bas dans le puits de sorte que le bas de l’insert se trouve juste au-dessus des cellules C2C12 sous-jacentes. Retournez les constructions d’insertion de puits dans l’incubateur.
   note: Ne laissez pas le bas de l’insert toucher physiquement et perturber mécaniquement les cellules C2C12 sous-jacentes.
7. Laissez les cellules migrer pendant un total de 9 à 12 h. Pour déterminer le temps de migration optimal, vérifiez les cellules 6 h après la création de la plaie, puis toutes les 2 à 3 h par la suite. Terminez l’expérience lorsque les cellules en conditions de contrôle ou de contrôle positif commencent à recouvrir complètement la plaie.
   note: Étant donné la nature sans contact de la construction, il n’est pas nécessaire de retirer l’insert sus-jacent des puits lors de la vérification de la progression de la migration d’intervalle. La variabilité migratoire sera observée en fonction de facteurs tels que les types de cellules utilisés dans cet essai, la densité cellulaire au moment de la génération de la plaie, la largeur de la plaie créée et les conditions expérimentales des cellules manipulées (p. ex., inactivation de gènes, ajout de protéines recombinantes). Les concentrations de ces réactifs doivent être déterminées expérimentalement à l’aide des recommandations du fabricant.

Résultats

Figure 1 : Modèle schématique du test.L’étape 1 comprend l’expansion in vitro des myoblastes C2C12 et des NCC à l’aide de cellules nourricières STO. L’étape 2 implique l’enrobage des cellules NCC et C2C12 dans le système de coculture. L’étape 3 comprend le test de plaie effectué dans les cellules C2C12 sous-jacentes pour évaluer la capacité migratoire cellulaire. L’étape 4 implique l’...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
C2C12 lignée cellulaire de myoblastes murins	ATCC	CRL-1772
Système de glissière à chambre, 4 puits	ThermoFisher Scientific	154526
Moyen d’aigle modifié (DMEM) de Dulbecco, teneur élevée en glucose (4,5 g/L), lglutamine (2 mM)	Corning	10-017-CV	Stocké à 4 °C
Pointes de pipette graduées et stériles, 10 μL	Scientifique américain	Référence 1111-3810
Lignée cellulaire de la crête neurale O9-1	Millipore Sigma	SCC049
Solution saline tampon phosphate (PBS), 1x, sans calcium ni magnésium, pH 7,4	Corning	Référence 21-040-CV	Stocké à 4 °C
Support perméable Falcon pour plaque à 24 puits avec membrane PET transparente de 0,4 μM	Corning	353095
Sérum fœtal bovin	Fisher Scientific	Réf. W3381E	Stocké dans des aliquotes de 50 mL à -20 °C
Microscope optique inversé Zeiss Axio Vert.A1	Carl Zeiss AG
Logiciel de microscopie Zen lite 2012	Carl Zeiss AG		Logiciel d’imagerie