Dosage immuno-enzymatique pour vérifier les conjugués anticorps-antigène couplés chimiquement

Résumé

Source : Volckmar, J. et al., Conjugaison chimique d’un anticorps purifié dirigé contre DEC-205 avec une protéine pleine longueur pour cibler les cellules dendritiques de souris in vitro et in vivo. J. Vis. Exp. (2021)

Cette vidéo montre la détection de complexes anticorps-antigène chimiquement conjugués via la technique ELISA (Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent assay). L’anticorps capturé se lie à l’épitope spécifique de l’antigène du conjugué anticorps-antigène, qui peut être visualisé plus tard à l’aide d’un anticorps secondaire lié à une enzyme.

Protocole

1. Production d’αDEC-205 à partir de la lignée cellulaire d’hybridome NLDC-145

1. Pour la production d’anticorps, décongelez dans un bain d’eau des cellules NLDC-145 cryopréservées produisant αDEC-205 à 37 °C. Dilatez les cellules à 37 °C et 5 % de CO₂. Deux flacons^{de 2} de 75 cm seront nécessaires pour procéder à la production d’anticorps. Les procédures de culture cellulaire doivent être effectuées dans une enceinte de sécurité pour assurer des conditions de travail sûres et éviter la contamination des cultures.
   1. Mettre en suspension 1 mL de cellules décongelées (1 x 10⁶ - 5 x 10⁶ cellules/mL) dans 9 mL de milieu ISF-1 complété par 1 % de pénicilline/streptomycine (préchauffé à 37 °C) dans un flacon de culture cellulaire (25 cm²). Placer le ballon horizontalement dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C, 5 % de CO₂.
   2. Cultivez les cellules à 37 °C et 5 % de CO₂, jusqu’à 70 % de confluence. Cela devrait normalement être réalisé après 24 à 48 heures.
   3. Une fois que les cellules sont confluentes à 70 %, transférez la suspension complète de cellules NLDC-145 (10 ml) dans un tube à centrifuger conique de 15 ml à l’aide d’un contrôleur de pipette avec une pipette dans une plage de volume de 1 à 10 ml. Granulez les cellules par centrifugation à 250 x g pendant 10 min à température ambiante.
   4. Préchauffer le milieu ISF-1 à 37 °C dans un bain-marie et remettre la pastille en suspension dans 12 ml de milieu ISF-1 complété par 1 % de pénicilline ou de streptomycine. Transvaser la suspension cellulaire remise en suspension dans un ballon de culture cellulaire frais (75 cm²).
   5. Cultiver et étendre les cellules dans le milieu ISF-1 complété par 1 % de pénicilline/streptomycine à 37 °C et 5 % de CO₂, jusqu’à ce que 70 % soient confluents et viables à 99 %. Cela devrait normalement être réalisé après 48 à 72 h.
   6. Divisez les cellules en deux flacons^{de 2} de 75 cm. Pour ce faire, rincez d’abord le fond du flacon de culture cellulaire/la surface de culture avec la suspension cellulaire pour retirer toutes les cellules NLDC-145 de la surface. Transvaser 6 mL de suspension cellulaire NLDC-145 chacun dans l’une des deux bouteilles fraîches de^{75 cm 2} et ajouter un milieu ISF-1 préchauffé complété par 1 % de pénicilline/streptomycine jusqu’à 12 mL.
      note: Ne renouvelez pas le milieu de culture cellulaire car les cellules NLDC-145 auront conditionné le milieu. Transférez les cellules avec leur milieu et remplissez la culture jusqu’au volume souhaité avec du milieu frais. Ceci est crucial pour la viabilité et la production maximale d’anticorps par les cellules NLDC-145.
   7. Étendre les cultures cellulaires à 37 °C et 5 % de CO₂, jusqu’à environ 70 % de confluent, ce qui est généralement atteint après 48 à 72 h.
   8. Une fois que les cellules sont confluentes à 70 %, transférez 10 ml de la suspension cellulaire expansée NLDC-145 de chacune des bouteilles de^{75 cm 2} dans une bouteille à roulettes en PETG (polyéthylène téréphtalate glycol) (1 050 cm²). Pour ce faire, rincez le fond du ballon de culture cellulaire/la surface de culture avec la suspension cellulaire pour retirer toutes les cellules de la surface à l’aide d’un contrôleur de pipette et d’une pipette de 10 ml.
   9. Ajouter 140 ml de milieu ISF-1 complété par de la pénicilline/streptomycine à 1 % (préchauffé à 37 °C) directement à partir de la bouteille moyenne à chacun des flacons roulants NLDC-145 en les remplissant jusqu’à la marque de 150 ml.
      note: Voir la remarque à l’étape 1.1.6.
   10. Cultivez les flacons roulants à 37 °C, 5 % de CO₂ et 25 tours/min pendant trois jours.
   11. Ajouter 150 mL de milieu ISF-1 complété par de la pénicilline/streptomycine à 1 % (préchauffé à 37 °C) à chacun des flacons roulants contenant du NLDC-145, en les remplissant jusqu’à la marque de 300 mL.
   12. Cultivez les flacons roulants contenant maintenant 300 ml de culture chacun à 37 °C, 5 % de CO₂ et 25 tours/min pendant trois jours supplémentaires.
   13. Ajouter 100 mL de milieu ISF-1 complété par de la pénicilline/streptomycine à 1 % (préchauffé à 37 °C) à chacun des flacons roulants contenant du NLDC-145, les remplissant ainsi jusqu’à 400 mL.
   14. Cultivez les flacons roulants contenant maintenant 400 ml de culture chacun à 37 °C, 5 % de CO₂ et 25 tours/min pendant sept jours supplémentaires.
       note: Au cours de cette semaine, la culture devient très dense (jusqu’à 95 % de densité) et la viabilité diminue (jusqu’à 50 %), ce qui permet une libération maximale d’anticorps.
2. Pour la purification de l’αDEC-205 à partir du surnageant de culture, verser la suspension cellulaire NLDC-145 (à partir des deux flacons roulants) directement dans des flacons de centrifugation autoclavés de 500 ml.
   note: Un volume total de 800 mL de culture doit être recueilli.
   1. Centrifugez la culture pendant 30 min à 8 600 x g et 4 °C pour éliminer les cellules et les débris.
   2. Collectez les surnageants, jetez les pastilles et regroupez-les dans une bouteille de réactif stérile.
      note: La purification de l’αDEC-205 peut être commencée immédiatement (étape 2) ou le surnageant peut être stocké à court terme à 4 °C.

2. Purification de l’anticorps αDEC-205 à partir du surnageant cellulaire NLDC-145

REMARQUE : À partir du surnageant de cellule NLDC-145, αDEC-205 est purifié à l’aide d’une colonne de sépharose de protéine G (réutilisable). Les dimensions de la colonne sont de 15 mm x 74 mm et 5 mL de protéine G Sepharose sont emballés par colonne.

1. Pour la préparation et le lavage de la colonne de sépharose de protéine G, placez un bouchon en caoutchouc hermétique sur l’ouverture supérieure de la colonne de sépharose de protéine G. Percez le bouchon en caoutchouc à l’aide de deux canules stériles (20 G x 1 1/2", 0,90 x 40 mm).
   1. Connectez une seringue de 10 ml à l’une des deux canules et un tube en silicone flexible (environ 100 cm de long, 2,5 à 3 mm de diamètre) avec un connecteur de tube à la deuxième canule.
      note: La construction seringue/bouchon en caoutchouc est réutilisable et fournit un vide résultant en un flux continu du grand volume de surnageant de culture vers la colonne de sépharose de la protéine G. À cette fin, tirez légèrement vers l’arrière le piston de la seringue pour assurer un écoulement continu du fluide dans les étapes suivantes.
   2. Lavez la colonne avec 50 ml d’acide acétique glacial 0,1 M (pH 2) pour éliminer les anticorps potentiellement restants de toute purification d’anticorps précédente. Placez l’extrémité du tube en silicone dans le flacon de réactif rempli d’acide acétique glacial (pH 2) de 0,1 M. À la suite du vide induit, 50 mL d’acide acétique glacial 0,1 M (pH 2) s’écoulent goutte à goutte à travers la colonne de sépharose de protéine G.
      REMARQUE : L’acide acétique glacial 0,1 M (pH 2) doit être stocké dans un flacon de réactif ou fraîchement rempli dans un bécher.
   3. Lavez la colonne avec 100 à 200 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Placez l’extrémité du tube de silicone dans une bouteille de réactif ou un bécher rempli de PBS. Laissez 100 à 200 ml de PBS s’écouler goutte à goutte dans la colonne de sépharose de la protéine G.
2. Pour la purification d’anticorps à partir du surnageant NLDC-145, chargez 800 mL du surnageant NLDC-145 (obtenu à l’étape 1.2.2.) sur la colonne. Insérez l’extrémité du tube de silicium dans le flacon de réactif rempli de surnageant NLDC-145. Laisser 800 mL de surnageant NLDC-145 s’écouler goutte à goutte dans la colonne.
   1. Lavez la colonne avec 500 mL de PBS. Mettez l’extrémité du tube de silicium dans une bouteille ou un bécher de réactif rempli de PBS. Laissez couler 500 mL de PBS dans le sens de la goutte à travers la colonne.
   2. Pour l’élution, utilisez 20 tubes de 1,5 mL et pipetez 100 μL de Tris-HCl de 1,5 M (pH 8,8) dans chaque tube de 1,5 mL. Retirer le bouchon en caoutchouc de la colonne et pipeter 1 mL de glycine 0,1 M (pH 3) jusqu’à la chambre supérieure de la colonne de sépharose de protéine G pour éluer l’anticorps de la colonne. Recueillir l’écoulement directement sous forme d’éluat dans l’un des tubes de 1,5 mL préparés.
   3. Répétez l’étape d’élution (2.2.2.) pour les 20 tubes (1,5 ml).
   4. Déterminer la densité optique de toutes les fractions d’élution à 280 nm (OD₂₈₀) à l’aide d’un spectrophotomètre afin d’identifier les fractions contenant des anticorps.
      note: Utilisez la première fraction d’élution comme blanc.
   5. Regroupez toutes les fractions dont la DO₂₈₀ est supérieure à 0,5 (environ 10 fractions).
   6. Stockez la colonne de sépharose de protéine G remplie d’éthanol à 20 % à 4 °C.
3. Dialyser les élutions regroupées contre 1000 mL de PBS (dans un bécher de 2000 mL) à 4 °C pendant la nuit à l’aide d’une tubulure de dialyse avec une coupure de poids moléculaire (MWCO) de 12 à 14 kDa.
   1. Coupez la tubulure de dialyse en morceaux de 20 cm. Faites bouillir la tubulure de dialyse dans 500 à 800 mL d’EDTA 10 mM (pH 7,5) pendant 30 min dans un bécher à l’aide d’une plaque chauffante pour éliminer la contamination. Jeter la solution de 10 mM d’EDTA (pH 7,5) et faire bouillir la tubulure de dialyse dans de l’eau désionisée pendant 10 min
      note: La tubulure de dialyse peut être utilisée directement ou stockée dans une solution d’azoture de sodium à 0,01 % (NaN₃)/H₂O à 4 °C jusqu’à la prochaine utilisation.
   2. Fermez le bas de la tubulure de dialyse à l’aide d’un bouchon de dialyse approprié/d’une pince à charnière monobloc et pipetez soigneusement l’élution de l’anticorps dans la tubulure de dialyse. Fermez le haut de la tubulure de dialyse à l’aide d’une deuxième pince.
   3. Fixez la pince supérieure de la tubulure de dialyse à un support flottant, assemblez-la avec une barre d’agitation magnétique dans le bécher rempli de PBS et placez le bécher sur un agitateur magnétique.
   4. Dialyser pendant la nuit en remuant à 4 °C.
4. Pour augmenter la concentration de αDEC-205, chargez le dialysat complet sur un concentrateur centrifuge avec 10 kDa MWCO. Ouvrez une pince de la tubulure et pipetez soigneusement l’ensemble du dialysat hors de la tubulure de dialyse dans le concentrateur centrifuge (10 kDa MWCO).
   note: Ne touchez pas le fond du concentrateur avec la pointe de la pipette.
   1. Centrifugeuse pendant 30 min à 693 x g (2 000 tr/min) et 4 °C.
   2. Chargez le concentrateur centrifuge avec 10 mL de PBS et centrifugez à 693 x g (2 000 tr/min) et 4 °C jusqu’à ce que le volume final de solution d’anticorps restant soit de 1 à 1,5 mL
      note: Si nécessaire, répétez l’étape de centrifugation de 2.4.1. pour ajuster à la quantité souhaitée.
   3. À l’aide d’un spectrophotomètre, déterminer la densité optique de la solution concentrée d’αDEC-205 à 280 nm (DO₂₈₀). Utilisez PBS comme vide.
   4. Calculer la concentration de αDEC-205 à l’aide de la formule suivante :
      concentration [mg/mL] = DO₂₈₀/1,4.
   5. Filtrez la solution αDEC-205 à l’aide d’une unité de filtre à seringue de 0,22 μm.
      note: La purification de l’αDEC-205 à partir du surnageant de cellule de l’hybridome NLDC-145 peut également être réalisée par FPLC (chromatographie liquide à protéine rapide). L’αDEC-205 purifié peut être stocké à 4 °C ou à -18 °C pour un stockage à long terme.

3. Conjugaison chimique de l’OVA à αDEC-205

REMARQUE : Un rapport de 0,5 mg de protéine OVA pour 2,5 mg d’αDEC-205 (1:5) est nécessaire pour une conjugaison chimique optimale. Cependant, ce rapport peut varier pour d’autres protéines et anticorps et doit être optimisé pour d’autres conjugués. La réduction des liaisons disulfure de la protéine OVA est réalisée par incubation avec 30 mM de TCEP-HCl, qui expose les groupes sulfhydryles pour la conjugaison chimique à αDEC-205 et 240 μl de TCEP-HCl sont nécessaires à l’étape 3.2. Les deux étapes, la réduction de l’OVA induite par le TCEP (étape 3.1.) et l’activation sulfo-SMCC de l’αDEC-205 (étape 3.2.) doivent de préférence être effectuées en parallèle.

1. Préparez fraîchement une solution de TCEP-HCl de 125 mM (pH 7,0). Pesez la quantité souhaitée de TCEP-HCl et dissolvez le TCEP-HCl dans une base Tris 0,9 M (pH 8,8). À l’aide de bandelettes indicatrices de pH, testez le pH de la solution de TCEP-HCl de 125 mM (qui doit être neutre) et ajustez le pH avec une base Tris (pH 8,8).
   1. Pipeter une solution protéique OVA de 200 μL (contenant 0,5 mg d’OVA) dans un tube stérile de 1,5 mL. À l’aide d’une pipette, ajoutez 240 μl de TCEP-HCl et 560 μL de TCEP-HCl stérile et 560 μL d’eau ultrapure à la protéine OVA à l’aide d’une pipette jusqu’à une concentration finale de 0,5 mg/mL de protéine OVA et de 30 mM de TCEP-HCl (OVA/TCEP-HCl).
      REMARQUE : 2,5 mg d’OVA EndoGrade (lyophilisé) sont dissous dans 1 mL de PBS, ce qui donne une solution d’OVA à 2,5 mg/mL.
   2. Incuber l’OVA/TCEP-HCl obtenu à température ambiante pendant 1,5 h
      note: Ne prolongez pas cette étape d’incubation.
2. Pour activer αDEC-205 pour la conjugaison, dissoudre 2 mg de sulfo-SMCC dans 100 μL d’eau ultrapure.
   note: Le sulfo-SMCC est sensible à l’hydrolyse. Par conséquent, il faut manipuler rapidement de plus grandes quantités de sulfo-SMCC non dissous ou utiliser des aliquotes de 2 mg disponibles.
   1. Diluer l’αDEC-205 dans du PBS de manière à ce que 2,5 mg soient contenus dans 900 μL.
   2. Mélanger 2,5 mg d’αDEC-205 (volume de 900 μL ; obtenu à l’étape 3.2.1) et 100 μL de sulfo-SMCC (obtenu à l’étape 3.2) dans un tube de 1,5 mL, pour obtenir un volume total de 1 mL.
   3. Incuber la solution αDEC-205/sulfo-SMCC pendant 30 min à 37 °C et 550 tr/min dans un bloc chauffant.
3. À la suite de ces incubations, les excès de sulfo-SMCC et de TCEP-HCl sont immédiatement éliminés des solutions à l’aide de colonnes de dessalage (MWCO 7 kDa ; volume de colonne de 5 mL).
   1. Dévissez la fermeture inférieure des colonnes (MWCO 7 kDa), desserrez le capuchon et placez la colonne dans un tube conique de 15 ml.
   2. Centrifuger pendant 2 min à 1 000 x g à température ambiante pour éliminer le liquide.
   3. Placez la colonne dans un tube frais et retirez le bouchon. Chargez lentement l’anticorps/sulfo-SMCC et l’OVA/TCEP-HCl, respectivement, au centre du lit de résine compact d’une colonne chacun.
   4. Centrifuger pendant 2 min à 1 000 x g à température ambiante.
   5. Jetez les colonnes après utilisation. Les solutions contenant des anticorps et des OVA amorcés pour la conjugaison se trouvent dans les tubes.
   6. Mélanger immédiatement les deux solutions par pipetage pour la conjugaison de αDEC-205 et d’OVA.
   7. Incuber le mélange αDEC-205 et OVA obtenu pendant une nuit à 4 °C.
4. Après la conjugaison, l’excès d’OVA non lié est éliminé de la solution et l’αDEC-205/OVA couplé est concentré à l’aide d’un concentrateur centrifuge de protéines (MWCO 150 kDa).
   1. Pré-rinçage du concentrateur centrifuge de protéines (MWCO 150 kDa) en pipetant 12 mL de PBS sur la colonne et en centrifugeant pendant 2 min à 2 000 x g à température ambiante.
      note: Si nécessaire, répéter l’étape de centrifugation (3.4.1.) jusqu’à ce qu’un volume d’environ 5 mL ait traversé la colonne.
   2. Avant de charger l’αDEC-205/OVA dans le concentrateur centrifuge de protéines, conservez un échantillon de 20 μL de l’αDEC-205/OVA non concentré pour l’analyse par transfert Western. Conserver cette aliquote à 4 °C jusqu’à l’analyse.
   3. Chargez l’αDEC-205/OVA sur le concentrateur de protéines centrifuge par pipetage.
      note: Evitez tout contact avec le lit de la chambre supérieure du concentrateur centrifuge.
   4. Remplissez le concentrateur à 15 ml de PBS et centrifugez-le pendant 5 min à 2 000 x g à température ambiante.
   5. Conservez un échantillon de la voie continue (voie I) pour l’analyse par transfert Western et jetez le reste de la voie continue.
   6. Remplissez le concentrateur à 10 ml de PBS et centrifugez-le pendant au moins 8 minutes à 2 000 x g à température ambiante.
   7. Conservez un échantillon pour le deuxième flux continu (flux II) pour l’analyse par transfert Western et jetez le reste du flux continu.
   8. Une fois l’enrichissement souhaité atteint (environ 1,5 mL de la solution αDEC-205/OVA doit être laissé dans la chambre supérieure), aspirez doucement l’échantillon concentré.
      note: S’il reste trop de liquide dans la chambre supérieure, la centrifugation peut être répétée, mais elle doit être aussi courte que possible.
5. Déterminer la concentration en protéines de l’αDEC-205/OVA résultant à l’aide d’un spectrophotomètre à microvolume. Utilisez PBS comme vide.
6. Filtrez l’αDEC-205/OVA à l’aide d’une unité de filtre à seringue de 0,22 μm.
   note: Pour des analyses ultérieures et des expériences in vivo, αDEC-205/OVA peut être stocké à 4 °C ou -18 °C.

4. Vérification de la conjugaison chimique par ELISA

1. Effectuer un test ELISA pour une vérification plus poussée de la conjugaison chimique réussie aboutissant à αDEC-205/OVA.
2. Enduire une plaque ELISA appropriée de 96 puits avec 100 μL/puits d’anticorps αOVA de lapin de 3 ng/μL dans un tampon d’enrobage (bicarbonate de sodium 0,1 M (NaHCO₃), pH 9,6 dilué dans H₂O).
   1. Incuber la plaque pendant une nuit à 4 °C.
3. Après le revêtement, lavez la plaque trois fois avec du PBS, par exemple à l’aide d’une rondelle ELISA.
4. Bloquer la plaque en pipetant 200 μL de tampon de blocage (10 % de FCS dans le PBS) dans chaque puits de la plaque et incuber la plaque pendant 30 min à température ambiante.
5. Diluer en série αDEC-205/OVA (obtenu à l’étape 3.6.) 1:2 dans un tampon de blocage (10 % de FCS dans du PBS) pour obtenir des dilutions allant de 6 μg/mL à 93,8 ng/mL αDEC-205/OVA et ajouter 100 μL/puits de ces quantités décroissantes de αDEC-205/OVA dans les puits.
   1. Incuber la plaque pendant 1 h à température ambiante.
6. Lavez la plaque trois fois avec du PBS, par exemple à l’aide d’une rondelle ELISA.
7. Ajouter 100 μL de l’anticorps αrat-IgG+IgM(H+L)-HRPO de chèvre (dilué à 1:2 000 dans un tampon bloquant (10 % de FCS dans le PBS)) dans chaque puits de la plaque.
   1. Incuber 1 h à température ambiante.
8. Lavez la plaque trois fois à l’aide de PBS, par exemple à l’aide d’une rondelle ELISA.
9. Ajouter 50 μL de substrat HRPO dans les puits. Lors de l’observation d’une réaction de couleur claire, arrêtez la réaction par l’ajout de 150 μl de solution d’arrêt (1M H₂SO₄) par puits.
10. Après 5 min, absorption de lecture à 450 nm à l’aide d’un lecteur ELISA.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tampon de blocage (ELISA)			10 % FBS en PBS
Fiole de culture cellulaire T25	Greiner Bio-One	690175	nous utilisons des flacons de culture cellulaire à capuchon filtrant standard CELLSTAR ; alternativement, nous utilisons des flacons de culture en suspension (690195 )
Fiole de culture cellulaire T75	Greiner Bio-One	658175	nous utilisons des flacons de culture cellulaire à capuchon filtrant standard CELLSTAR, ou des flacons de culture en suspension (658195)
Fiole de culture cellulaire T175	Greiner Bio-One	661175	nous utilisons des flacons de culture cellulaire à capuchon filtrant standard CELLSTAR ; nous utilisons également des flacons de culture en suspension (661195)
Concentrateur centrifuge MWCO 10 kDa	Sartorius	VS2001	Concentrateur centrifuge Vivaspin 20
Concentrateur centrifuge de protéines MWCO 100 kDa, 5 - 20 ml	Thermo Fisher Scientific	Référence 88532	Concentrateur de protéines Pierce, PES 5 -20 ml ; nous utilisons le concentrateur Pierce 150K MWCO 20mL (numéro de catalogue 89921), qui n’est cependant plus disponible
Flacons à centrifuger	Nalgene	Référence 525-2314	PPCO (copolymère de polypropylène) avec bouchon à vis en PP (polypropylène), 500 ml ; obtenu auprès de VWR, Allemagne
Tampon d’enrobage (ELISA)			0,1 M de bicarbonate de sodium (NaHCO3) dans H2O (pH 9,6)
Colonnes de dessalage MWCO 7 kDa	Thermo Fisher Scientific	Référence 89891	Thermo Scientific Colonnes de dessalage Zeba Spin, 7K MWCO, 5 mL
Réactif de détection ELISA (substrat HRPO)	Sigma-Aldrich/Merck	Réf. T8665-100ML	Système de substrat liquide 3,3′,5,5′-tétraméthylbenzidine (TMB)
Plaque ELISA 96 puits	Thermo Fisher Scientific	442404	Plaque MaxiSorp Nunc-Immuno
Sérum de veau fœtal	PAN-BIOtech	Réf. P40-47500	FBS Bon point fort
ISF-1 moyen	Biochrom/bioswisstec	F 9061-01
Hybridome NLDC-145	ATCC	HB-290	si ce n’est pas déjà à portée de main, les cellules d’hybridome peuvent être acquises à partir de l’ATCC
Ovalbumine	Hyglos (via BioVendor)	Référence 321000	EndoGrade OVA ultra-pur avec <0,1 UE/mg
Pénicilline/streptomycine	Thermo Fisher Scientific	15140122	Gibco Pénicilline/Streptomycine 10.000 U/ml ; alternativement Gibco Pénicilline/Streptomycine 5.000 U/ml (15070-063) peut être utilisé
Flacons roulants de culture cellulaire en polyéthylène téréphtalate de glycol PETG	Nunc In Vitro	Tél. : 734-2394	revêtement PDL standard, ventilé (1,2X), 1050 cm², volume de 100 à 500 ml ; obtenu auprès de VWR, Allemagne
Bandelettes indicatrices de pH	Merck	109535	Bandelettes indicatrices de pH 0-14
Anticorps polyclonaux αrat-IgG+IgM-HRPO de chèvre (ELISA)	Jackson ImmunoResearch	Référence 112-035-068	obtenu de Dianova, Allemagne ; utilisé à 1:2000 pour l’ELISA
Lapin polyclonal αOVA (ELISA)	Abcam	AB181688	Utilisé à 3 ng/μl
Protéine G Colonne de sépharose	Merck/Millipore	Réf. P3296	5 ml de protéine G Sepharose, Fast Flow sont emballés dans une colonne vide-10 (Merck, GE 17-0435-01)
Bouchon en caoutchouc	Omnilab	5230217	Bouchons en caoutchouc DEUTSCH & NEUMANN (Φ inférieur 17 mm ; Φ 22 mm supérieur)
Tube en silicone	Omnilab	5430925	DEUTSCH & NEUMANN (intérieur Φ 1 mm ; extérieur Φ 3 mm)
Mince et rapide			nous avons utilisé du chocolat Slim-Fast ordinaire disponible gratuitement en pharmacie, car dans cette approche western blot, il a donné de meilleurs résultats que le lait en poudre
Solution d’arrêt (ELISA)			1 M H2SO4
Sulfo-SMCC	Thermo Fisher Scientific	Référence 22322	Réticulant Pierce Sulfo-SMCC ; utiliser également le numéro de catalogue A39268 (10 x 2 mg)
Unité de filtre à seringue 0,22 μm	Merck/Millipore	SLGV033RS	Millex-GV Unité de filtration de seringue, 0,22 μm, PVDF, 33 mm, stérilisé aux rayons gamma
Seringue 10 ml	Omnilab		Seringues jetables Injekt® Solo B.Braun
Canules stéricanes®	B. Braun		Sterican® G 20 x 1 1/2" » ; 0,90 x 40 mm ; jaune
TCEP-HCl	Thermo Fisher Scientific	N° A35349
Connecteur de tube	Omnilab		Connecteurs de tubes miniatures Kleinfeld pour tube en silicone