Dosage des comètes pour la détection des dommages à l’ADN dans les cellules

Résumé

Source : Ji, Y., et al. Une approche de dosage de comète à haut débit pour évaluer les dommages à l’ADN cellulaire. J. Vis. Exp. (2022).

La vidéo montre le test de comète pour détecter les dommages à l’ADN après une exposition à des agents nocifs. Dans des conditions alcalines, l’ADN se déroule et se dénature, et lors de l’électrophorèse, l’ADN intact et endommagé migre différemment dans le gel d’agarose, formant une structure en forme de comète. L’ADN non endommagé qui migre lentement forme la tête de comète circulaire, tandis que les fragments d’ADN endommagés qui migrent rapidement forment la queue de comète allongée.

Protocole

1. Préparation des matériaux pour le dosage des comètes

1. Préparation des lames de microscope
   1. Verser 1 % (p/v) d’agarose à point de fusion normal [dissoute dans de l’eau doublement distillée (ddH₂O)] dans un tube de 50 mL et au micro-ondes pour dissoudre l’agarose dans le ddH₂O. Conserver à 37 °C pour éviter la solidification avant de revêtir les lames. En cas de solidification, jeter et préparer frais.
   2. Pré-enrobez les lames de microscope en les trempant dans le tube de 50 mL contenant 1 % (p/v) d’agarose à point de fusion normal.
   3. Essuyez rapidement le dos des diapositives après les avoir trempées.
      note: Le fait de ne pas essuyer correctement le dos des lames augmentera le bruit de fond des lames lors de l’analyse étape par microscope.
   4. Étiquetez la lame enduite à l’aide d’un marqueur permanent dans le coin inférieur droit de la section givrée (Figure 1A). Cela indique quel côté de la diapositive est pré-enduit.
   5. Laissez l’agarose prendre et sécher toute la nuit à température ambiante.
   6. Enveloppez les lames séchées dans du papier de soie et rangez-les dans une boîte.

2. Préparation des échantillons

1. Cellules cultivées
   note: Tout d’abord, traitez les cellules avec le(s) agent(s) dommage(s) avant de commencer le test de comète. Ensuite, effectuez les opérations suivantes.
   1. Si les cellules sont adhérentes, trypsinisez les cellules pour les libérer du ballon de culture cellulaire ou des boîtes de Pétri de culture cellulaire, à la confluence appropriée des cellules. Neutralisez la trypsine en ajoutant des milieux contenant du sérum.
   2. Transférez les cellules dans un tube de 50 ml, centrifugez-les (par exemple, pour les HaCaTs, centrifugez-les à 300 x g pendant 5 minutes à température ambiante), retirez délicatement le surnageant et ajoutez 1 ml de PBS à la pastille de cellule.
   3. Effectuez le comptage des cellules.
   4. Transférez 30 000 cellules dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et centrifugez-les à 7 607 x g pendant 5 min à 4 °C.
   5. Retirez délicatement le surnageant et stockez la pastille cellulaire sur de la glace dans l’obscurité avant d’effectuer le test de comète.
      note: Les cellules doivent être régulièrement testées pour la contamination par les mycoplasmes avant d’effectuer le test de comète afin de prévenir, entre autres effets, la formation de dommages artéfactuels à l’ADN et une réponse modifiée aux dommages à l’ADN, comme indiqué. Les conditions de centrifugation peuvent être modifiées, au besoin, en fonction du type de cellule utilisé.
2. Préparation de cellules cultivées pour l’essai de réparation
   1. Cultivez des cellules dans le ballon de culture cellulaire ou dans des boîtes de Pétri.
   2. Laver les cellules avec 1 mL de PBS deux fois avant de traiter les cellules avec des agents nocifs (par exemple, pour les cellules BE-M17, traiter avec 50 μM de H₂O₂ pendant 20 min) sur de la glace pour éviter que la réparation ne se produise pendant le traitement.
   3. Lavez doucement les cellules avec 1 ml de PBS deux fois pour éliminer tout agent nocif résiduel.
   4. Réintroduire le milieu de culture cellulaire et laisser les cellules se réparer pendant des durées variables (p. ex., 0 min, 30 min, 2 h, 6 h, 24 h et 30 h) dans un incubateur humidifié (37 °C, 5 % CO₂).
   5. À chaque étape, prélevez 30 000 cellules dans un milieu de culture cellulaire contenant 10 % de diméthylsulfoxyde (DMSO) et stockez-les à -80 °C.
   6. Avant d’effectuer le test des comètes, décongelez rapidement les cellules à 37 °C dans un bain d’eau et centrifugez-les à 7 607 x g pendant 5 min à 4 °C.
   7. Retirer le surnageant et stocker la pastille de cellules sur de la glace avant d’effectuer l’essai (c.-à-d. à partir de l’étape 3).

3. Lyse cellulaire

REMARQUE : Effectuez toutes les procédures sur glace.

1. Utilisez 12 000 cellules ou 2,5 μL de sang total par gel.
2. Préparez de l’agarose à bas point de fusion à 0,6 % (p/v) dissoute dans du PBS à l’aide d’un micro-ondes et placez-la dans un bain-marie à 37 °C pour éviter qu’elle ne se solidifie.
3. Étiquetez l'extrémité givrée des lames pré-enduites avec le nom de l'investigateur, la date et les informations sur le traitement à l'aide d'un marqueur permanent ou d'un crayon.
4. Placez une plaque de refroidissement sur un banc plat et insérez les deux blocs réfrigérants congelés dans le tiroir coulissant sous la surface métallique (comme illustré à la Figure 2).
5. Placez les lames sur la plaque de refroidissement et laissez-les pré-refroidir pendant 1 à 2 minutes avant d’ajouter les cellules contenant de l’agarose à 0,6 % (p/v) contenant de l’agarose à faible point de fusion.
   note: Laisser les diapositives sur la plaque de refroidissement pendant plus de 1 à 2 minutes peut provoquer la formation de condensation sur la surface de la diapositive en raison de l’humidité ambiante. Cela peut rendre les gels d’agarose à bas point de fusion moins stables sur les lames.
6. Dispersez la pastille (étape 2.2.7) par vortex. Assurez-vous que tout le surnageant a été retiré de la pastille. Remettez immédiatement les tubes d’échantillon (contenant les cellules granulées) sur de la glace.
   note: Lorsque vous placez les tubes contenant l’échantillon dans la centrifugeuse, placez-les avec la charnière vers l’extérieur afin que la pastille soit recueillie de ce côté du tube. Parfois, il est difficile de voir la pastille et il est facile de la déloger tout en retirant le surnageant. La centrifugation avec le couvercle du tube dans cette orientation permettra de savoir où se trouvera la pastille cellulaire.
7. Remettez en suspension la pastille cellulaire avec 200 μL d’agarose à faible point de fusion à 0,6 % (agarose LMP) et mélangez en pipetant de haut en bas sans créer de bulles. Ensuite, transférez rapidement 80 μL de cellules contenant de l’agarose LMP sur une lame réfrigérée et placez rapidement une lamelle sur le gel.
8. Laissez le gel prendre sur la plaque de refroidissement pendant 1 à 2 min.
9. Pendant ce temps, préparez une solution de travail de 500 mL de tampon de lyse (tableau 1) et versez-la dans le plat de lyse (figure 3).
10. Une fois que les gels ont été pris, retirez rapidement les lamelles en tenant doucement la glissière entre le pouce et l’index et en faisant glisser la lamelle hors du gel.
11. Placez les lames contenant des échantillons à l’intérieur du support de lames (tous les « points » noirs sur les lames doivent être orientés dans la même direction lorsqu’elles sont placées dans un support) (Figure 1B), puis placez le support de lames à l’intérieur de la boîte de lyse (Figure 3).
12. Fermez le couvercle de la coupelle de lyse et conservez la coupelle au réfrigérateur pendant la nuit à 4 °C ou 30 min à température ambiante, selon ce qui convient le mieux à l'emploi du temps de l'opérateur.

4. Électrophorèse

1. Retirez délicatement le support de lames de la boîte de lyse. Veillez à ne pas déranger les gels.
2. Placez délicatement le porte-diapositives dans un plat à laver préchargé de ddH₂O glacé et laissez-le pendant 30 minutes en veillant à ce que les diapositives soient complètement recouvertes de ddH₂O.
3. Insérez un bloc réfrigérant congelé à l’intérieur du tiroir coulissant sous le réservoir d’électrophorèse pour maintenir une température tampon optimale.
4. Ajoutez délicatement une solution de travail d’électrophorèse glacée (Tableau 1) dans le réservoir d’électrophorèse et transférez le support de lame dans le réservoir d’électrophorèse. Orientez les lames de manière à ce que leurs parties transparentes avec les gels contenant des cellules (c’est-à-dire PAS les extrémités givrées/de marquage) pointent vers la cathode (électrode rouge).
5. Laissez les lames reposer dans le réservoir d’électrophorèse pendant 20 minutes afin que l’ADN se détende et se détende. Gardez l’alimentation électrique éteinte pendant cette étape.
6. Si nécessaire, insérez un nouveau bloc réfrigérant congelé pour maximiser le refroidissement.
7. Effectuez une électrophorèse pendant 20 min à 1,19 V/cm, ou dans toutes les conditions qui ont été optimisées.
   note: L’optimisation des conditions de fonctionnement de l’électrophorèse et du volume de tampon est recommandée pour chaque laboratoire. L’utilisation d’un seul support de lames pendant l’électrophorèse n’a pas d’effet des lames sur la résistance du tampon d’électrophorèse, et les auteurs n’ont pas constaté d’effet significatif sur la tension ou le courant lorsque le nombre de lames changeait.
8. Coupez l’alimentation électrique, retirez avec précaution le support de diapositives du réservoir d’électrophorèse et laissez-le s’écouler sur du papier de soie pendant 30 s.
9. Placez le support de glissière dans le plat contenant le tampon de neutralisation (Tableau 1). Laissez-le pendant 20 min.
10. Retirez le support de diapositives du plat de neutralisation, placez-le dans le plat de lavage contenant du ddH2O glacé et laissez-le pendant 20 min.
11. Retirez le porte-lames de l'eau et laissez-les sécher dans un incubateur à 37 °C pendant 1 h, ou à température ambiante pendant la nuit, ou ne séchez pas, selon l'horaire de l'opérateur.
    note: S’il n’y a pas de séchage à l’étape 4.11, effectuez l’étape de coloration à partir de 5.2.

5. Coloration à l’iodure de propidium (PI)

1. Transférez le support de lames dans un plat à laver contenant du ddH₂O glacé pour réhydrater les lames et laissez reposer 30 min.
2. Placez le support de lame dans un plat de coloration contenant une solution d’iodure de propidium de 2,5 μg/mL.
   note: L’iodure de propidium est sensible à la lumière, alors manipulez-le dans un endroit sombre. Il est également toxique.
3. Fermez le couvercle du plat de coloration et incubez-le pendant 20 min dans l’obscurité à température ambiante.
4. Transférez le support de diapositives dans un plat séparé et lavez-le avec du ddH₂O glacé pendant 20 min.
5. Retirez le support de lames de la boîte et séchez-le complètement dans l'obscurité, soit dans un incubateur à 37 °C, soit à température ambiante, selon l'horaire ou la préférence de l'opérateur.
6. Une fois les lames complètement sèches, retirez-les du support de lames et rangez-les dans une boîte à lames dans l’obscurité jusqu’à ce qu’elles soient prêtes pour l’analyse de l’image.
   note: Les diapositives resteront lisibles indéfiniment et pourront être recolorées si nécessaire.

6. Scoring des comètes et analyse des données

REMARQUE : Le terme « comète » dérive des images des cellules endommagées lorsqu’elles sont observées au microscope après la réalisation du test (Figure 4). Dans des conditions d'électrophorèse, l'ADN des cellules non endommagées ne migre en grande partie pas, mais reste dans un sphéroïde appelé « tête » de comète. Cependant, la présence de cassures de brins permet à l'ADN de la cellule de migrer hors de la tête et de former une « queue », conduisant ainsi à une apparence de comète (Figure 4). Plus il y a d’ADN dans la queue, plus les dommages sont importants.

1. Allumez le microscope à fluorescence avec le filtre PI (rouge) (λ = 536/617 nm) et le logiciel de score de dosage des comètes.
2. Ajoutez une goutte d’eau à l’aide d’une pipette Pasteur dans le gel et recouvrez d’une lamelle.
3. Placez les lames dans le microscope à fluorescence et « notez » les comètes.
   note: Le scoring est un moyen par lequel les comètes sont évaluées, afin de déterminer l’ampleur des dommages présents dans chaque comète. D'une manière générale, cela peut être réalisé en utilisant deux approches, selon les préférences choisies par l'utilisateur, soit à l'œil nu (en mesurant la taille des comètes sur une échelle de zéro à quatre), soit en utilisant des logiciels libres ou disponibles dans le commerce30. En général, les deux approches évaluent la taille de la queue de la comète, bien qu’une variété de points d’extrémité liés à la comète puissent être déterminés. Si vous utilisez le logiciel, cliquez sur le milieu de la tête de la comète et attendez que le logiciel détecte automatiquement la comète, puis évalue le point final choisi (Figure 4).
4. Évaluez 50 comètes par gel et 100 comètes par échantillon (c’est-à-dire que chaque échantillon correspond à différents traitements endommageant l’ADN, ou à leurs réplications).
5. Répétez les expériences (n = 2) ou triplez les expériences (n = 3).
   note: Si seulement n=2 expériences répétées sont entreprises, l'analyse statistique ne peut pas être effectuée, mais si n=3, effectuez le test de normalité de D'agostino. La plupart des données d’analyse des comètes ne passent pas un test de normalité. Dans ce cas, utilisez un test non paramétrique (test de Kruskal-Wallis avec test de comparaisons multiples de Dunn, et tests de signification de Mann-Whitney fixés à p < 0,05).

Réactif	Solution mère	Solution fonctionnelle
Tampon de lyse	100 mM Na2EDTA, 2,5 M NaCl et 10 mM Tris Base en ddH2O ; ajuster le pH à 10 avec 10 M NaOH	Triton X-100 à 1 % dans une solution mère de lyse
Tampon d’électrophorèse	10 M NaOH et 200 mM Na2EDTA en jjH2O	300 mM de NaOH et 1 mM de Na2EDTA ; pH > 13
Tampon de neutralisation	0,4 M Tris Base en ddH2O ; ajuster le pH à 7,5 avec HCl
Tampon de coloration	1 mg/mL d’iodure de propidium	2,5 μg/mL d’iodure de propidium dans ddH2O

Tableau 1 : Composition des réactifs utilisés dans le dosage des comètes alcalines à haut débit (HTP ACA). Les concentrations de stock et de travail des tampons de lyse, d’électrophorèse, de neutralisation et de coloration sont indiquées.

Résultats

Figure 1 : Images représentatives d’une lame de test de comète et d’un rack HTP (support de lame de microscope). (A) Pour une orientation correcte, la face pré-enduite de la lame de microscope est reconnue par un point noir dans le coin droit d’une lame de microscope. (B) L’image du rack HTP illustre comment les lames sont maintenues dans une orientation verticale serrée, avec des languettes s...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
22 lamelles en verre de 22 x 22 mm	Fisher Scientific, Hampton, NH, États-Unis	Référence 631-0124
Microscope à fluorescence équipé avec un appareil photo	Zeiss, Iéna, Allemagne
Système d’analyse HTP Comet	Cleaver Scientific	COMPAC- 50
Kératinocytes humains (HaCaT)	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, Virginie, États-Unis	Abandonné	Peut être acheté auprès d’un autre Entreprise ADDEXBIO TECHNOLOGIES Cat# T0020001
Peroxyde d’hydrogène (H2O2) 30 % dans l’eau	Fisher Scientific, Hampton, NH, États-Unis	Réf. BP2633-500
Logiciel d’analyse d’images et de données	Instrument perceptif, Bury St Edmunds, Angleterre Royaume-Uni	125525	Logiciel d’analyse d’images gratuit is disponible, par exemple, ImageJ
Agarose à bas point de fusion	Invitrogen Waltham, MA, États-Unis	Réf. P4864
Na2 EDTA (disodique acide éthylènediaminetétraacétique)	Sigma Aldrich, Saint-Louis, MO, États-Unis	E5134
NaCl (chlorure de sodium)	Sigma Aldrich, Saint-Louis, MO, États-Unis	Réf. S7653
Nanopure Infinity Eau ultrapure Système (Barnstead Nanopure)	Thermo Scientific, Waltham, MA, États-Unis	Réf. D11901	Eau ultrapure (16 MΩ cm^{-1} )
NaOH (hydroxyde de sodium)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis	E5134
Point de fusion normal Agarose	Fisher Scientific, Hampton, NH, États-Unis	16520100	Pour le pré-revêtement des lames
Iodure de propidium (1,0 mg/mL dans l’eau)	Sigma Aldrich, Saint-Louis, MO, États-Unis	12-541BP486410ML
Microscope en verre mono-dépoli Diapositives	Fisher Scientific, Hampton, NH, États-Unis	12-541B
Boîte à diapositives	Fisher Scientific, Hampton, NH, États-Unis	Référence 03-448-2	Résistant à la lumière, pour protéger les cellules de la formation des dommages fortuits (selon l’opinion largement répandue) et prévenir la décoloration du fluorescent teindre
Plaque de refroidissement coulissante	Cleaver Scientific, Rugby, Angleterre, Royaume-Uni	CSL-CHILLPLATE
Plat de traitement	Cleaver Scientific, Rugby, Angleterre, Royaume-Uni	STAINDISH4X
Tris-base	Sigma Aldrich, Saint-Louis, MO, États-Unis	Référence 93362
Triton X-100	Fisher Scientific, Hampton, NH, États-Unis	BP151-500
Trypsine EDTA (0,5 %)	Invitrogen Gibco, Waltham, MA, États-Unis	15400054
Porte-glissière vertical	Cleaver Scientific, Rugby, Angleterre, Royaume-Uni	COMPAC-25