L’utilisation de matières radioactives (RAM) nécessite l’approbation préalable d’un comité de sécurité désigné dans chaque établissement.
1. Absorption des acides aminés dans les cellules
- Plaque 5 x 104 cellules ST2 dans chaque puits d’une plaque de culture tissulaire à 12 puits. Cellules sur plaque en α-MEM contenant 10 % de FBS, 100 U/mL de pénicilline et 0,1 μg/mL de streptomycine (Pen/Streptophyte). Plaquez des puits supplémentaires de cellules pour quantifier le nombre de cellules par condition pour les normalisations de l’étape 1.12. Incuber des cellules dans un incubateur de culture cellulaire humidifié à 37 °C avec 5 % de CO2.
- Cultivez les cellules pendant 2-3 jours jusqu’à ce qu’elles confluent.
- Le jour de l’expérience, préparez les solutions suivantes : 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,4 et tampon Krebs Ringers HEPES (KRH), pH 8,0 : (120 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, NaHCO3, 5 mM HEPES, 1 mM D-Glucose). Préchauffer à 37 °C.
- Aspirez le milieu et lavez les cellules deux fois avec 1 mL de 1x PBS, pH 7,4.
note: Ce protocole est également approprié pour la division rapide des cellules non confluentes. Dans ce cas, il est important de normaliser la radioactivité au nombre absolu de cellules ou au contenu en ADN. De plus, envisagez d’augmenter la taille de la plaque ou du flacon de culture pour augmenter le nombre total de cellules et les valeurs CPM. Il est important de le déterminer empiriquement sur une base individuelle.
- Aspirez 1x PBS et lavez une fois les cellules avec 1 mL de KRH.
- Produire 4 μCi/mL de L-[3,4-3 H]-glutamine en diluant 4 μL de [1 μCi μL-1] L-[3,4-3 H]-glutamine par 1 mL de KRH.
note: Avant d’utiliser des matières radioactives, veuillez communiquer avec le Bureau de la radioprotection de votre établissement d’attache pour obtenir les approbations. Toutes les procédures liées aux radiations doivent être effectuées derrière l’écran en plexiglas.
- Incuber des cellules avec 0,5 mL de KRH contenant 4 μCi/mL de L-[3,4-3 H]-Glutamine pendant 5 min.
- Récupérez le fluide radioactif et distribuez-le dans le conteneur à déchets liquides. Lavez brièvement les cellules trois fois avec du KRH glacé pour mettre fin à la réaction. Récupérez et jetez tous les lavages dans le conteneur de déchets liquides radioactifs.
- Ajouter 1 mL de SDS à 1 % dans chaque puits et triturer 10 fois pour lyser et homogénéiser les cellules. Transférez les lysats cellulaires dans des tubes de 1,5 ml. Jetez les plaques de culture cellulaire, les pipettes sérologiques et les pointes de pipette dans le conteneur de déchets radioactifs solides.
- Centrifuger à >10 000 x g pendant 10 min. Transférer les surnageants dans des flacons à scintillation contenant 8 mL de solution à scintillation. Mélangez en secouant vigoureusement les flacons à scintillation. Jeter les tubes et les pointes de pipette dans le conteneur de déchets radioactifs solides.
- Lire la radioactivité en comptages par minute (cpm) à l’aide d’un compteur à scintillation. Jetez les flacons à scintillation dans le conteneur à déchets de flacons à scintillation.
- Trypsiniser, remettre en suspension et compter les cellules des plaques non radioactives restantes (voir l’étape 1.1) pour estimer le nombre de cellules dans les cultures radioactives lysées. À l’aide d’un hémocytomètre, comptez le nombre de cellules par puits non radioactif pour chaque condition expérimentale. Normalisez le cpm de l’étape 1.11 au nombre de cellules estimé à partir des plaques non radioactives.
- Une fois l’expérience terminée, décontaminer le capot de culture cellulaire, le banc et tous les instruments avec un spray décontaminant pour la radioactivité. Enfin, effectuez des tests d’essuyage pour vous assurer que la zone de travail est exempte de rayonnement.
