1. Culture synchronisée de C. elegans
- Avant l’ensemencement, cultiver la souche OP50 d’Escherichia coli (E. coli) pendant une nuit à 37 °C dans 300 mL de milieu liquide de bouillon Luria-Bertani (LB). Conservez l’OP50 cultivé à -4 °C.
- Pour préparer un milieu liquide de bouillon LB, utilisez 10 g de tryptone, 5 g d’extrait de levure, 10 g de NaCl et 1,5 ml de 1 N NaOH, et ajoutez-les à 1 L avec de l’eau désionisée. Autoclave.
note: Les souches OP50 et C. elegans sont disponibles au Caenorhabditis Genetics Center (Université du Minnesota, St. Paul, MN, États-Unis).
- Pour fabriquer un milieu de croissance pour nématodes, utilisez 3 g de NaCl, 2,5 g de peptone, 17 g de gélose et 975 ml d’eau déminéralisée. Autoclave. Refroidir à 55 °C, puis ajouter stérilement, dans l’ordre, 1 mL de 1 M de MgSO4, 1 mL de 1 M de CaCl2, 1 mL de 5 mg/mL de cholestérol dans de l’EtOH et 25 mL de phosphate de potassium 1 M pH 6,0 dans des boîtes de Pétri de 90 mm.
- Pour un phosphate de potassium de 1 M pH 6,0, utilisez 108,3 g de KH2PO4 et 46,6 g de K2HPO4, et ajoutez de l’eau désionisée à 1 L. Autoclave.
- Étaler 1 à 2 mL d’OP50 cultivé sur les plaques de gélose NGM. Pour faire une fine couche d’OP50, incubez les plaques pendant la nuit à température ambiante avant d’ajouter les nématodes.
note: Les plaques de gélose NGM inoculées OP50 peuvent être conservées à température ambiante pendant 2-3 semaines.
- Ajouter au moins 100 vers sur une plaque de gélose NGM avec OP50 et cultiver à 20 °C jusqu’au stade adulte. Au moins trois plaques sont nécessaires.
- Pour recueillir les œufs in utero, transférez les hermaphrodides gravides des trois plaques de gélose NGM contenant chacune 5 mL de tampon S dans un tube conique de 15 mL, et lavez les vers 3 fois avec 15 mL de tampon S par centrifugation à 300 x g pendant 30 s à température ambiante.
- Pour faire un tampon S, utilisez 5,9 g de NaCl et 50 ml de phosphate de potassium 1 M pH 6,0, et ajoutez-les à 1 L avec de l’eau désionisée. Autoclave.
- Dissoudre les vers dans une solution alcaline d’hypochlorite pour l’axénisation et l’isolement des œufs en vrac (0,5 mL d’eau de Javel fraîche ou l’équivalent : 5 à 6 % d’hypochlorite de sodium, 0,1 mL de 10 M de NaOH, environ 4,5 mL de tampon S), et laisser reposer la solution pendant 10 à 15 minutes à température ambiante en mélangeant par inversion.
note: En 15 minutes, les vers adultes doivent se dissoudre, laissant une solution trouble d’œufs libérés de leurs carcasses (les œufs libérés doivent être confirmés à l’aide d’un microscope stéréoscopique). Au lieu de 0,1 mL de NaOH 10 N, 0,2 mL de NaOH 5 N peut également être utilisé.
- Après le traitement à l’hypochlorite, laver la pastille d’œuf 3 fois avec 15 ml de tampon S et la remettre en suspension dans 5 à 6 ml de tampon S. Faites éclore les œufs libérés pendant une nuit d’incubation à 20 °C dans un tampon S sans E. coli pour une culture synchronisée selon l’âge des larves du stade L1.
- Pour déterminer le nombre approximatif de larves du stade L1, comptez les vers à l’aide d’un microscope stéréoscopique dans 10 μL de tampon S après avoir remis les larves en suspension au moins 3 fois, et calculez la moyenne. Ensuite, transférez les larves du stade L1 dans cinq plaques de gélose NGM avec OP50 (1 500 à 3 000 vers par plaque à l’aide d’une boîte de Pétri de 90 mm), et cultivez-les à 20 °C jusqu’à ce qu’elles aient atteint le stade de jeune adulte lorsque l’autofécondation commence et que quelques œufs sont pondus (généralement après 3 jours).
2. Extraction de la fraction cellulaire de C. elegans
- Prélever les vers au stade adulte (animaux âgés de 5 jours) dans les cinq plaques de gélose NGM avec tampon S (figure 1A).
- Pour ne sélectionner que des vers vivants à l’aide de la méthode du saccharose 6 pour la flottation sur du saccharose à 30 % (p/v), mélanger les vers en suspension dans 3 à 4 mL de tampon S avec un volume égal de saccharose glacé à 60 % (p/v) dans un tube conique de 15 mL. Faites tourner le tube à 1 500 x g pendant 15 s à 4 °C et retirez les vers flottants dans un tube frais en les décollant de la paroi du tube à l’aide d’une pipette Pasteur.
- Laver les vers 3 fois avec le tampon S par centrifugation à 1 500 x g pendant 30 s à 4 °C. Vérifier le volume humide des vers lavés après centrifugation à l’aide d’une pointe de micropipette de 1 000 μL (figure 1B).
- Ajouter les vers lavés à un volume égal d’acide trichloracétique (TCA) glacé à 10 % (p/v ; concentration finale de 5 %) pour la précipitation des protéines (figure 1C). Au lieu du TCA, on peut utiliser de l’acide perchlorique (PCA) ou de l’acide métaphosphorique.
- Homogénéisez les vers avec le précipitant à l’aide de 40 coups de pilon dans un homogénéisateur en téflon (broyeur de tissus Potter-Elvehjem) avec rotation jusqu’à 1 300 tr/min sur glace.
- Transférez l’homogénat dans un microtube frais de 1,5 mL à l’aide d’une pipette Pasteur et sonifiez à l’aide d’un homogénéisateur à ultrasons pendant 3 minutes (3 fois de 1 min) avec un cycle de service de 20 % sur glace.
- Clarifier l’homogénat par centrifugation à 8 000 x g pendant 10 min à 4 °C. Neutraliser les surnageants avec 4 M KOH (0,25 volume à 10 % de TCA) pendant 20 min sur glace, et centrifuger à 8 000 x g pendant 10 min à 4 °C. Le surnageant (sous forme d’échantillon d’essai) peut être stocké à -80 °C jusqu’aux tests suivants.
3. Dosage du lactate à l’aide d’un kit de dosage colorimétrique
- Mesurer la concentration de lactate dans les échantillons d’essai à l’aide d’un kit de dosage colorimétrique (Table des matériaux). Effectuer des examens duplex pour les échantillons de test. Ajoutez 5 ou 10 μL des échantillons d’essai dans une plaque de 96 puits et ajustez le volume à 50 μL par puits avec le tampon de dosage de lactate fourni avec le kit.
- Pour obtenir la courbe de lactate standard, diluer 100 mM de L(+)-lactate standard à 1 mM avec un tampon de dosage de lactate. Ajoutez 0, 2, 4, 6, 8 et 10 μL de l’étalon de L(+)-lactate de 1 mM, fourni avec le kit, dans une série de puits.
- Ajouter 50 μL de mélange réactionnel (contenant 46:2:2 de tampon de dosage de lactate, de mélange d’enzymes de lactate et de sonde de lactate dans du DMSO, anhydre ; tous les réactifs sont fournis avec la trousse) ou de mélange de contrôle de fond (contenant 48:2 de tampon de dosage de lactate et de sonde de lactate) dans chaque puits et incuber à température ambiante pendant 30 à 60 minutes pendant que les échantillons sont à l’abri de la lumière.
- Mesurez l’absorbance de chaque puits à 570 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques et soustrayez l’absorbance du mélange de contrôle d’arrière-plan de l’absorbance du mélange de réaction.
- Tracez la courbe standard du lactate. Calculer les concentrations de lactate dans les échantillons d’essai à partir de la courbe étalon de lactate.
