Dosage du pyruvate pour l’estimation des concentrations de pyruvate dans les fractions cellulaires des vers

Résumé

Source : Yanase, S. et al. Dosages colorimétriques à petite échelle du lactate et du pyruvate intracellulaires chez le nématode Caenorhabditis elegans.J. Vis. Exp. (2018).

Cette vidéo décrit un test colorimétrique pour mesurer quantitativement le pyruvate dans les fractions cellulaires de Caenorhabditis elegans. En utilisant le peroxyde d’hydrogène produit à partir de la réaction enzymatique de la pyruvate oxydase avec le pyruvate cellulaire, un colorant chromogène est oxydé pour produire un produit coloré, mesuré à l’aide de la colorimétrie pour déterminer la concentration de pyruvate.

Protocole

1. Culture synchronisée de C. elegans

1. Avant l’ensemencement, cultiver la souche OP50 d’Escherichia coli (E. coli) pendant une nuit à 37 °C dans 300 mL de milieu liquide de bouillon Luria-Bertani (LB). Conservez l’OP50 cultivé à -4 °C.
   1. Pour préparer un milieu liquide de bouillon LB, utilisez 10 g de tryptone, 5 g d’extrait de levure, 10 g de NaCl et 1,5 ml de 1 N NaOH, et ajoutez-les à 1 L avec de l’eau désionisée. Autoclave.
      note: Les souches OP50 et C. elegans sont disponibles au Caenorhabditis Genetics Center (Université du Minnesota, St. Paul, MN, États-Unis).
2. Pour fabriquer un milieu de croissance pour nématodes, utilisez 3 g de NaCl, 2,5 g de peptone, 17 g de gélose et 975 ml d’eau déminéralisée. Autoclave. Refroidir à 55 °C, puis ajouter stérilement, dans l’ordre, 1 mL de 1 M de MgSO₄, 1 mL de 1 M de CaCl₂, 1 mL de 5 mg/mL de cholestérol dans de l’EtOH et 25 mL de phosphate de potassium 1 M pH 6,0 dans des boîtes de Pétri de 90 mm.
   1. Pour un phosphate de potassium de 1 M pH 6,0, utilisez 108,3 g de KH₂PO₄ et 46,6 g de K₂HPO₄, et ajoutez de l’eau désionisée à 1 L. Autoclave.
3. Étaler 1 à 2 mL d’OP50 cultivé sur les plaques de gélose NGM. Pour faire une fine couche d’OP50, incubez les plaques pendant la nuit à température ambiante avant d’ajouter les nématodes.
   note: Les plaques de gélose NGM inoculées OP50 peuvent être conservées à température ambiante pendant 2-3 semaines.
4. Ajouter au moins 100 vers sur une plaque de gélose NGM avec OP50 et cultiver à 20 °C jusqu’au stade adulte. Au moins trois plaques sont nécessaires.
5. Pour recueillir les œufs in utero, transférez les hermaphrodides gravides des trois plaques de gélose NGM contenant chacune 5 mL de tampon S dans un tube conique de 15 mL, et lavez les vers 3 fois avec 15 mL de tampon S par centrifugation à 300 x g pendant 30 s à température ambiante.
   1. Pour faire un tampon S, utilisez 5,9 g de NaCl et 50 ml de phosphate de potassium 1 M pH 6,0, et ajoutez-les à 1 L avec de l’eau désionisée. Autoclave.
6. Dissoudre les vers dans une solution alcaline d’hypochlorite pour l’axénisation et l’isolement des œufs en vrac (0,5 mL d’eau de Javel fraîche ou l’équivalent : 5 à 6 % d’hypochlorite de sodium, 0,1 mL de 10 M de NaOH, environ 4,5 mL de tampon S), et laisser reposer la solution pendant 10 à 15 minutes à température ambiante en mélangeant par inversion.
   note: En 15 minutes, les vers adultes doivent se dissoudre, laissant une solution trouble d’œufs libérés de leurs carcasses (les œufs libérés doivent être confirmés à l’aide d’un microscope stéréoscopique). Au lieu de 0,1 mL de NaOH 10 N, 0,2 mL de NaOH 5 N peut également être utilisé.
7. Après le traitement à l’hypochlorite, laver la pastille d’œuf 3 fois avec 15 ml de tampon S et la remettre en suspension dans 5 à 6 ml de tampon S. Faites éclore les œufs libérés pendant une nuit d’incubation à 20 °C dans un tampon S sans E. coli pour une culture synchronisée selon l’âge des larves du stade L1.
8. Pour déterminer le nombre approximatif de larves du stade L1, comptez les vers à l’aide d’un microscope stéréoscopique dans 10 μL de tampon S après avoir remis les larves en suspension au moins 3 fois, et calculez la moyenne. Ensuite, transférez les larves du stade L1 dans cinq plaques de gélose NGM avec OP50 (1 500 à 3 000 vers par plaque à l’aide d’une boîte de Pétri de 90 mm), et cultivez-les à 20 °C jusqu’à ce qu’elles aient atteint le stade de jeune adulte lorsque l’autofécondation commence et que quelques œufs sont pondus (généralement après 3 jours).

2. Extraction de la fraction cellulaire de C. elegans

1. Prélever les vers au stade adulte (animaux âgés de 5 jours) dans les cinq plaques de gélose NGM avec tampon S (figure 1A).
   1. Pour ne sélectionner que des vers vivants à l’aide de la méthode du saccharose 6 pour la flottation sur du saccharose à 30 % (p/v), mélanger les vers en suspension dans 3 à 4 mL de tampon S avec un volume égal de saccharose glacé à 60 % (p/v) dans un tube conique de 15 mL. Faites tourner le tube à 1 500 x g pendant 15 s à 4 °C et retirez les vers flottants dans un tube frais en les décollant de la paroi du tube à l’aide d’une pipette Pasteur.
2. Laver les vers 3 fois avec le tampon S par centrifugation à 1 500 x g pendant 30 s à 4 °C. Vérifier le volume humide des vers lavés après centrifugation à l’aide d’une pointe de micropipette de 1 000 μL (figure 1B).
3. Ajouter les vers lavés à un volume égal d’acide trichloracétique (TCA) glacé à 10 % (p/v ; concentration finale de 5 %) pour la précipitation des protéines (figure 1C). Au lieu du TCA, on peut utiliser de l’acide perchlorique (PCA) ou de l’acide métaphosphorique.
4. Homogénéisez les vers avec le précipitant à l’aide de 40 coups de pilon dans un homogénéisateur en téflon (broyeur de tissus Potter-Elvehjem) avec rotation jusqu’à 1 300 tr/min sur glace.
5. Transférez l’homogénat dans un microtube frais de 1,5 mL à l’aide d’une pipette Pasteur et sonifiez à l’aide d’un homogénéisateur à ultrasons pendant 3 minutes (3 fois de 1 min) avec un cycle de service de 20 % sur glace.
6. Clarifier l’homogénat par centrifugation à 8 000 x g pendant 10 min à 4 °C. Neutraliser les surnageants avec 4 M KOH (0,25 volume à 10 % de TCA) pendant 20 min sur glace, et centrifuger à 8 000 x g pendant 10 min à 4 °C. Le surnageant (sous forme d’échantillon d’essai) peut être stocké à -80 °C jusqu’aux tests suivants.

3. Dosage du pyruvate à l’aide d’un kit de dosage colorimétrique

1. Mesurer la concentration de pyruvate dans les surnageants (échantillons d’essai) à l’aide d’un kit de dosage colorimétrique (Table des matériaux). Effectuer des examens duplex pour les échantillons de test. Ajouter 10 μL des échantillons d’essai et 90 μL de réactif de travail (contenant 94:1 de mélange d’enzymes et de réactif de colorant, fournis avec le kit) dans une plaque à 96 puits et incuber à température ambiante pendant 30 min pendant que les échantillons sont à l’abri de la lumière.
2. Mesurer l’absorbance de chaque puits à 570 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques.
3. Tracez la courbe standard du pyruvate. Calculer les concentrations en pyruvate des échantillons d’essai à partir de la courbe étalon de pyruvate.

Résultats

Graphique 1. Procédé d’extraction de métabolites cellulaires. (A) De 1 500 à 3 000 vers ont été placés sur une plaque de gélose NGM (boîte de Pétri de 90 mm). L’extraction des vers sur cinq plaques a été suffisante pour les tests colorimétriques. (B) Les vers collectés à partir des cinq plaques de 3 000 et 1 500 vers par plaque sont indiqués respectivement sur...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Kit de dosage EnzyChrom Pyruvate	Systèmes de bioessais	#EPYR-100	dosages colorimétriques/fluorométriques 100 ; Conserver à -20°C
Acide trichloracétique	Wako Pure Chemical	#207-04955	Conserver à température ambiante
Homogénéisateur en téflon	Iwaki/Pyrex	#358034 (Wheaton)	Au lieu d’Iwaki/Pyrex, disponible par Wheaton