Dosage spectrophotométrique pour déterminer l’activité de la glycogène synthase

Résumé

Source : Wilson W.A., Méthodes spectrophotométriques pour l’étude du métabolisme du glycogène eucaryote. J. Vis. Exp. (2021).

Cette vidéo décrit un test spectrophotométrique pour l’estimation de l’activité de la glycogène synthase. La méthode repose sur la réduction de l’absorbance du NADH avec le temps et indique l’activité de la glycogène synthase.

Protocole

1. Détermination de l’activité de la glycogène synthase

1. Préparer les solutions mères des réactifs requis comme indiqué dans le tableau 1 (avant la journée d’expérimentation).
2. Le jour de l’essai, préparer une solution fraîche de 4 mM de NADH en dissolvant 4,5 mg de NADH dans 1,5 mL de 50 mM de Tris-HCl, pH 8,0. Conserver sur de la glace, à l’abri de la lumière.
3. Décongeler des solutions mères d’UDP-glucose, d’ATP, de phosphoénolpyruvate et de kinase NDP sur de la glace.
4. Préchauffez un bain-marie à 30 °C.
5. Installer chaque dosage de glycogène synthase dans un tube de 1,5 mL en ajoutant les réactifs du mélange réactionnel énumérés au tableau 2.
   note: Pour faciliter la mise en place, un mélange maître peut être réalisé contenant suffisamment de chacun des réactifs énumérés ci-dessus pour compléter le nombre de tests prévus.
6. Préparez une réaction à blanc, où le NADH dans le mélange ci-dessus est remplacé par de l’eau. Transférez-le dans une cuvette en méthacrylate jetable et utilisez-la pour régler le zéro sur le spectrophotomètre à 340 nm.
7. Prélever une tranche de 770 μL de l’aliquote du mélange réactionnel dans un tube de 1,5 mL. Ajouter 2 μL de kinase NDP et 2 μL de mélange pyruvate kinase/lactate déshydrogénase, mélanger doucement et incuber à 30 °C pendant 3 min pour préchauffer le mélange réactionnel.
8. Ajouter 30 μL de l’échantillon contenant de la glycogène synthase dans un tampon Tris de 20 mM, pH 7,8 ; mélanger et transférer le mélange réactionnel dans une cuvette en méthacrylate jetable.
9. Placez la cuvette dans le spectrophotomètre et enregistrez l’absorbance à 340 nm à intervalles réguliers pendant 10 à 20 min. Tracez les absorbances obtenues en fonction du temps.
   note: Une réaction au cours de laquelle l’échantillon de glycogène synthase est remplacé par un tampon Tris de 20 mM doit être effectuée pour contrôler l’oxydation non enzymatique du NADH. Selon la pureté de l’échantillon, d’autres réactions de contrôle peuvent être nécessaires.
10. Déterminez la vitesse de réaction.

Tableau 1 : Solutions mères nécessaires au dosage de l’activité de la glycogène synthase.

composant	Itinéraire
50 mM Tris pH 8,0	Dissoudre 0,61 g de base Tris dans ~ 80 mL d’eau. Réfrigérer à 4 °C. Ajuster le pH à 8,0 avec du HCl et augmenter le volume à 100 mL avec de l’eau.
Tampon HEPES de 20 mM	Dissoudre 0,477 g de HEPES dans ~ 80 mL d’eau. Ajustez le pH à 7,0 avec du NaOH et augmentez le volume à 100 ml avec de l’eau.
132 mM tampon Tris/32 mM KCl pH 7,8	Dissoudre 1,94 g de base Tris et 0,239 g de KCl dans ~90 mL d’eau. Ajustez le pH à 7,8 avec du HCl et augmentez le volume à 100 ml avec de l’eau.
0,8 % p/v Glycogène d’huître	Pesez 80 mg de glycogène d’huître et ajoutez-le à l’eau. Porter le volume final à 10 ml avec de l’eau et réchauffer doucement/mélanger pour dissoudre complètement le glycogène.
100 mM UDP-glucose	Dissoudre 0,31 g de glucose UDP dans l’eau et porter le volume final à 1 mL. Conserver dans des aliquotes, congelé à -20 °C. Stable pendant plusieurs mois.
50 mM d’ATP	Dissoudre 0,414 g d’ATP dans ~ 13 mL d’eau. Ajustez le pH à 7,5 avec du NaOH et augmentez le volume à 15 mL avec de l’eau. Conserver dans des aliquotes congelées à -20 °C. Stable pendant plusieurs mois.
100 mM Glucose-6-phosphate pH 7,8	Dissoudre 0,282 g de glucose-6-phosphate dans ~ 7 à 8 mL d’eau. Ajustez le pH à 7,8 avec du NaOH. Augmentez le volume à 10 mL avec de l’eau. Conserver congelé dans des aliquotes à -20 °C. Stable pendant au moins six mois.
40 mM de phosphoénolpyruvate	Dissoudre 4 mg de phosphoénolpyruvate dans 0,5 mL de tampon HEPES de 20 mM pH 7,0. Conserver à -20 °C. Stable pendant au moins 1 semaine.
0,5 M MnCl2	Dissoudre 9,90 g de MnCl2 dans un volume final de 100 mL d’eau.
Kinase NDP	Reconstituer la poudre lyophilisée avec suffisamment d’eau pour donner une solution à 1 U/μl. Préparez des aliquotes, congelez-les dans de l’azote liquide et conservez-les à -80 °C. Stable pendant au moins 1 an.

Tableau 2 : Composition du mélange réactionnel pour le dosage de l’activité de la glycogène synthase.

composant	Volume (μl)
160 mM tampon Tris/32 mM KCl pH 7,8	250
Eau	179
100 mM de glucose-6-phosphate, pH 7,8	58
0,8 % p/v de glycogène d’huître	67
50 mM d’ATP	80
4 mM de NADH	80
100 mM UDP-glucose	28
40 mM de phosphoénolpyruvate	20
0,5 M MnCl2	8
Volume final	770

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Amylopectine (sans amylose) provenant du maïs cireux	Fisher Scientific	A0456
amylose	Biosynth Carbosynth	YA10257
ATP, sel disodique	MilliporeSigma	A3377
D-Glucose-1,6-bisphosphate, sel de potassium	MilliporeSigma	Référence G6893
D-glucose-6-phosphate, sel de sodium	MilliporeSigma	G7879
Glucose-6-phosphate déshydrogénase, grade I, de levure	MilliporeSigma	10127655001
Glycogène de type II provenant de l’huître	MilliporeSigma	Référence G8751
Hexokinase	MilliporeSigma	11426362001
Cuvettes en méthacrylate, 1,5 mL	Fisher Scientific	Tél. : 14-955-128	Le méthacrylate est nécessaire car certaines procédures sont effectuées à 340 nm ou moins
β-Nicotinamide, adénine dinucléotide, phosphate, sel de sodium	MilliporeSigma	N0505
β-Nicotinamide adénine dinucléotide, sel disodique réduit	MilliporeSigma	Référence 43420
Nucléoside 5'-diphosphate kinase	MilliporeSigma	N0379
Phosphoénolpyruvate, sel monopotassique	MilliporeSigma	Réf. P7127
Phosphoglucomutase du muscle du lapin	MilliporeSigma	Réf. P3397
Phosphorylase A du muscle de lapin	MilliporeSigma	Réf. P1261
Enzymes pyruvate kinase/déshydrogénase lactique du muscle de lapin	MilliporeSigma	Réf. P0294
UDP-glucose, sel disodique	MilliporeSigma	Référence U4625