REMARQUE : Pendant toutes les expériences, gardez les plaques sur des surfaces non électrostatiques en tout temps, comme les emballages en papier de l’emballage. Suivez la section 1 ci-dessous pour déterminer la concentration la plus appropriée de cellules à ensemencer dans la plaque de microtitration électronique (conçue comme E-Plate).
1. Détermination de la quantité de cellules appropriée pour infecter les cellules
- Préparez des cellules MDCK (Madin-Darby Canine Kidney) dans des flaconsde 75 cm 2 pour obtenir des cellules fraîchement divisées (environ 80 % de confluence) 24 h avant l’expérience.
- Lavez les cellules avec 5 ml de 1x PBS et détachez-les en ajoutant 3 ml de solution de trypsine-EDTA à 0,25 %.
- Ajouter 7 ml de milieu de culture cellulaire frais et compter les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé avec coloration au bleu trypan.
- Ajustez la concentration cellulaire à 400 000 cellules/mL avec un milieu de culture cellulaire. Effectuer des dilutions en série deux fois dans des tubes supplémentaires pour obtenir des densités cellulaires de 200 000 ; 100,000; 50,000; 25,000; 12,500; et 6 250 cellules/mL. Ajustez la plage de dilution des cellules en fonction du type de cellule et de leur comportement de croissance.
- Laissez la plaque E (Table des matériaux) à RT pendant plusieurs minutes et ajoutez 100 μL de milieu de culture cellulaire dans chaque puits à l’aide d’une pipette multicanaux. Ne touchez pas les électrodes de la E-Plate.
- Déverrouillez les berceaux et insérez l’extrémité avant de la plaque dans la poche du berceau de l’instrument de mesure d’impédance (tableau des matériaux). Fermez la porte de l’incubateur.
- Ouvrez le logiciel.
- Dans « Configuration du modèle d’expérience par défaut », choisissez la ou les stations d’accueil sélectionnées et double-cliquez sur la page supérieure, puis entrez le nom de l’expérience. Cliquez sur « Mise en page » et entrez les informations d’échantillon nécessaires pour chaque puits sélectionné de la plaque ; Ensuite, cliquez sur « Appliquer » lorsque vous avez terminé. Cliquez sur « Planifier » | « Étapes » | « Ajouter une étape ». Le logiciel ajoute automatiquement un pas de 1 s pour mesurer l’impédance de fond (CI).
- Cliquez sur « Démarrer/Continuer » dans l’onglet « Exécuter », cliquez sur « Tracer », ajoutez tous les échantillons en sélectionnant les puits appropriés, et assurez-vous que le CI est compris entre -0,1 et 0,1 avant de passer à l’étape suivante.
- Retirez la plaque du berceau.
- Ajouter 100 μL de chaque suspension cellulaire de l’étape 1.4 en double dans les puits appropriés et 100 μL de milieu cellulaire dans les puits utilisés comme témoins. Laisser la plaque E dans la hotte à flux laminaire pendant 30 min à RT pour permettre une répartition uniforme des cellules au fond des puits.
- Insérez la plaque E dans la poche du berceau. Cliquez sur « Planifier » | « Ajouter une étape » dans le logiciel et entrez des valeurs pour surveiller les cellules toutes les 30 minutes pendant 200 répétitions. Ensuite, sélectionnez « Démarrer/Continuer ».
- Vérifiez et tracez les données CI en cliquant sur le bouton « Plot » dans le logiciel. Sélectionner la concentration de cellules qui se trouvent juste avant la phase stationnaire 24 h après l’ensemencement sur la plaque, afin d’obtenir des cellules qui sont encore en phase de croissance lors de l’infection virale. La phase stationnaire est atteinte lorsque l’IC est à son maximum.