Dosage cellulaire basé sur l’impédance pour mesurer la multiplicité de l’infection du virus de la grippe

Résumé

Source : Labadie, T., et al., Surveillance de la survie du virus de la grippe à l’extérieur de l’hôte à l’aide de l’analyse cellulaire en temps réel. J. Vis. Exp. (2021)

Dans cette vidéo, nous abordons la corrélation entre le CIT₅₀ et la multiplicité des infections virales. Les cellules infectées par le virus présentent des effets cytopathiques, provoquant leur mort et leur détachement de la microélectrode d’or, ce qui réduit l’impédance.

Protocole

1. Corrélation entre les valeurs de CIT₅₀ et la multiplicité de l’infection

1. Ajouter 100 μL de milieu de culture 1x MEM stérile dans chaque puits de la plaque E. Insérez la plaque E dans la poche du berceau de l’instrument à 35°C.
2. Mesurez l’arrière-plan comme décrit :
3. Ouvrez le logiciel.
   1. Dans « Configuration du modèle d’expérience par défaut », choisissez la ou les stations d’accueil sélectionnées et double-cliquez sur la page supérieure, puis saisissez le nom de l’expérience. Cliquez sur « Mise en page » et entrez les informations d’échantillon nécessaires pour chaque puits sélectionné de la plaque ; Ensuite, cliquez sur « Appliquer » lorsque vous avez terminé. Cliquez sur « Planifier » | « Étapes » | « Ajouter une étape ». Le logiciel ajoute automatiquement un pas de 1s pour mesurer l’impédance de fond (CI).
   2. Cliquez sur « Démarrer/Continuer » dans l’onglet « Exécuter ». Cliquez sur « Tracer », ajoutez tous les échantillons en sélectionnant les puits appropriés, et assurez-vous que le CI est compris entre -0,1 et 0,1 avant de passer à l’étape suivante.
4. Retirez la plaque E du berceau.
5. Ensemencez 3 x 10⁴ de cellules MDCK fraîchement divisées sur chaque puits de la plaque de microtitration électronique et cultivez-les pendant 24h à 35°C avec 5 % de CO₂ afin qu’elles soient en phase de réplication pendant l’infection par IAV.
6. Infectez les cellules MDCK avec différentes dilutions 10 fois d’un titre connu de 6log₁₀TCID₅₀/mL du virus H1N1, en utilisant le pipetage inverse pour la reproductibilité en suivant les étapes ci-dessous :
   1. Rincez les cellules MDCK 2x avec 100 μL de MEM sans FCS (milieu de propagation de virus). Veillez à retirer tous les supports après le deuxième lavage pour éviter une dilution supplémentaire de l’inoculum.
   2. Ajouter 100 μL de suspension virale dans chaque puits à l’aide d’une pipette monocanal. Pour éviter la contamination, procédez en commençant de gauche à droite, puis de haut en bas dans la plaque tout en recouvrant les puits restants avec le couvercle.
   3. Insérez la plaque dans la poche du berceau de l’instrument à 35°C. Soyez doux pour éviter les mouvements brusques pouvant entraîner une contamination.
   4. Commencez à surveiller l’impédance de la cellule toutes les 15 minutes pendant au moins 100 h, comme décrit :
      1. Insérez la plaque E dans la poche du berceau. Cliquez sur « Planifier » | « Ajouter une étape » dans le logiciel et entrez des valeurs pour surveiller les cellules toutes les 30 minutes pendant 200 répétitions. Ensuite, sélectionnez « Démarrer/Continuer ».
   5. Après les deux cycles de mesures (c’est-à-dire 30 min), mettez l’appareil en pause en cliquant sur « Pause » dans l’onglet « Exécuter » et retirez la plaque E du berceau.
   6. Ajouter 1 g/mL de TPCK-trypsine dans le milieu de propagation du virus pour cliver l’hémagglutinine virale.
   7. Ajoutez 100 μL de milieu de propagation du virus contenant de la TPCK-trypsine dans chaque puits et insérez la plaque E dans la poche du berceau.
   8. Cliquez sur « Démarrer/Continuer » dans l’onglet « Exécuter ».
      note: N’oubliez pas de créer un contrôle négatif correspondant aux cellules faussement infectées en remplaçant la suspension virale par un milieu de propagation du virus.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
E-Plate 16 (6 plaques)	ACEA Biosciences, Inc	5469830001	Les E-plates sont disponibles dans différents emballages
MEM 1X	Technologies du vivant (gibco)	31095029
TPCK-Trypsine	Worthington	LS003740
Instrument d’analyse cellulaire en temps réel xCELLigence S16	ACEA Biosciences, Inc	380601310	Les instruments xCELLigence RTCA S16 sont disponibles en différents formats (16 puits, 96 puits, mono ou multiplaque)