1. Préparation des réactifs et des matières premières
- Préparation de cellules MDCK et milieu de culture cellulaire stérile
- Cultivez des cellules de rein canin Madin-Darby (MDCK) dans un milieu d'Eagle modifié (MEM) complété par 10 % de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur (FCS) et des antibiotiques (100 unités/ml de pénicilline, 100 mg/ml de streptomycine).
- Après décongélation, passez les cellules MDCK au moins 2x avant de les infecter pour assurer une récupération complète (mais moins de 30 passages pour éviter toute dérive des phénotypes cellulaires).
- Grainez 2 flacons de culture tissulaire de 75 cm contenant 30 mL de MEM stérile 1x avec7,5 x 10 cellules MDCK 6 et incubez à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2.
- Préparation des équipements de surveillance d’impédance
- Placez l’instrument dans l’incubateur à 35 °C et laissez-le se réchauffer pendant au moins 2 h.
- Connectez-le à l’unité de contrôle placée à l’extérieur de l’incubateur.
- Procédez aux procédures de nettoyage recommandées par le fabricant avant de commencer le reste de l’expérience.
- Production de stocks d’IAV sur cellules MDCK
- Pour propager et amplifier les virus H1N1, ensemencer 7,5 x 10cellules 6 MDCK dans deux flacons de culture tissulaire de75 cm 2, et incuber pendant 24 h à 37 °C pour atteindre une confluence de 90 % à 100 %.
- Décanter le milieu de culture cellulaire de la monocouche cellulaire dans 2 flacons de 75 cm. Lavez les cellules avec 5 ml de PBS 1x stérile.
- Retirez le PBS et ajoutez 5 ml de 1x PBS pour laver à nouveau les cellules.
- Étiquetez une fiole comme flacon de contrôle et retirez le PBS avant d’ajouter soigneusement 15 ml de support de propagation de virus (1x MEM avec 0 % de FCS) sur la monocouche. Incuber ce ballon dans un incubateur maintenu à 35 °C avec 5 % de CO2. Utilisez-le à titre de comparaison après 3 jours de propagation.
- Diluer le virus à la concentration appropriée dans un tube de 1,5 mL contenant un milieu de propagation du virus (1x MEM avec 0 % de FCS).
- Retirer 1 x PBS de la fiole de 75 cm2 et infecter les cellules MDCK à une multiplicité d’infection (MOI) de 1 x 10-3 ou 1 x 10-4 unités formant une plaque par cellule (pfu/cellule) en ajoutant 1 mL du virus dilué à la monocouche cellulaire.
- Adsorber le virus sur les cellules MDCK pendant 45 minutes à l’heure normale en remuant régulièrement la fiole toutes les 15 minutes.
- Retirer délicatement l’inoculum et ajouter 15 mL de milieu de propagation du virus par fiole contenant 1 μg/mL de TPCK-trypsine (trypsine/L-1-tosylamide-2-phényléthylchlorométhylcétone), afin de cliver l’hémagglutinine virale HA0 en sous-unités HA1 et HA2 (un événement nécessaire à la fusion de l’HA avec la membrane endosomale et à la libération du génome viral).
- Incuber les flacons à 35 °C et 5 % de CO2 pendant au moins 3 jours pour répliquer le virus.
- Observez les cellules MDCK au microscope à un grossissement de 40x et recherchez des effets cytopathiques (EPC) sur les cellules (en les comparant à la fiole de contrôle cellulaire). Si l’EPC n’est pas complète (c’est-à-dire qu’environ 80 % des cellules sont détachées du substrat), remettez les flacons dans l’incubateur pendant 24 heures supplémentaires.
- Lorsque l’EPC est terminée, décantez le surnageant de culture cellulaire et centrifugez-le à 300 x g pendant 10 minutes pour granuler les débris cellulaires.
- Transvaser le surnageant clarifié dans un tube de 15 mL et aliquote les virus de descendance dans des flacons cryogéniques stériles à usage unique. Placez immédiatement les cryotubes à -80 °C pour congeler et stocker les virus.
- Infectez les cellules MDCK avec différentes dilutions 10 fois d’un titre connu de 6 log10 TCID50/mL du virus H1N1, en utilisant le pipetage inverse pour la reproductibilité en suivant les étapes ci-dessous :
- Rincez les cellules MDCK 2x avec 100 μL de MEM sans FCS (milieu de propagation de virus). Veillez à retirer tous les supports après le deuxième lavage pour éviter une dilution supplémentaire de l’inoculum.
- Ajouter 100 μL de suspension virale dans chaque puits à l’aide d’une pipette monocanal. Pour éviter la contamination, procédez en commençant de gauche à droite puis de haut en bas dans la plaque tout en couvrant les puits restants avec le couvercle.
- Insérez la plaque dans la poche du berceau de l’instrument à 35 °C. Soyez doux pour éviter les mouvements brusques pouvant entraîner une contamination.
- Commencez à surveiller l’impédance de la cellule toutes les 15 minutes pendant au moins 100 h, comme décrit à l’étape 2.10.
- Après les deux cycles de mesures (c’est-à-dire 30 min), mettez l’appareil en pause en cliquant sur « Pause » dans l’onglet « Exécuter » et retirez la plaque E du berceau.
- Ajouter 1 μg/mL de TPCK-trypsine dans le milieu de propagation du virus pour cliver l’hémagglutinine virale.
- Ajoutez 100 μL de milieu de propagation du virus contenant de la TPCK-trypsine dans chaque puits et insérez la plaque E dans la poche du berceau. 8. Cliquez sur « Démarrer/Continuer » dans l’onglet « Exécuter<br />
note: N’oubliez pas de créer un contrôle négatif correspondant aux cellules faussement infectées en remplaçant la suspension virale par un milieu de propagation du virus.
2. Cinétique de survie IAV
- Exposez les IAV à de l’eau distillée salée à 35 °C et testez leur infectiosité au fil du temps en mesurant la diminution de l’impédance cellulaire.
- Préparez de l’eau distillée saline en ajoutant du NaCl à une concentration finale de 35 g/L dans de l’eau distillée. Ajouter 900 μL d’eau salée dans des cryotubes de 2 mL.
- Ajoutez 100 μL de stock viral dans de l’eau salée et placez les cryotubes dans un incubateur (35 °C, 5 % CO2) pendant 1 h, 24 h ou 48 h.
- Semez 100 μL (contenant 3 x 104) de cellules MDCK fraîchement divisées sur une plaque de microtitration à 16 puits et faites croître pendant 24 h à 37 °C et 5 % de CO2.
- Infectez les cellules avec 100 μL de virus exposés (préalablement dilués 10 fois dans des milieux de culture) en utilisant la méthode de pipetage inverse pour la reproductibilité en répétant la section 1.4.
- Surveillez l’impédance de la cellule toutes les 15 min pendant au moins 100 h.
