Dosage des substances réactives à l’acide thiobarbiturique pour évaluer le stress oxydatif dans le sérum humain

Résumé

Source : Borges, C. R. et al., Évaluation du stress oxydatif dans des échantillons biologiques à l’aide de l’essai des substances réactives de l’acide thiobarbiturique. J. Vis. Exp. (2020)

Cette vidéo présente le dosage des substances réactives de l’acide thiobarbiturique (TBARS) pour évaluer le stress oxydatif dans des échantillons biologiques.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local

1. Dosage TBARS

REMARQUE : Une fois que le test TBARS est commencé, il doit être terminé sans s’arrêter.

1. Prélever autant d’échantillons et d’étalons centrifugés à 1500 x g pendant 10 min à 4 °C. Après la centrifugation, conservez les tubes en verre contenant les échantillons et les étalons chez RT. Tubes en verre au besoin pour le nombre d’échantillons à analyser et étiquetez-les avec le nom des échantillons. Ensuite, ajoutez 100 μL de chaque échantillon préparé (lysats de cellules HepG2, lipoprotéines de basse densité, sérum humain) dans chaque tube de verre.
2. Ajoutez 200 μL de FDS à 8,1 % à chaque échantillon et étalon et faites tourner doucement le tube de verre dans un mouvement circulaire pour mélanger l’échantillon.
3. Ajouter 1,5 mL de tampon d’acétate de sodium 3,5 M (pH = 4) à chaque échantillon et à chaque étalon.
4. Ajouter 1,5 mL de tampon d’acétate de sodium 3,5 M (pH = 4) à chaque échantillon et à chaque étalon.
5. Porter le volume final à 4 mL pour chaque échantillon et étalon en ajoutant 700 μL d’eau DI.
6. Fermez hermétiquement chaque tube de verre et incubez dans un bloc chauffant réglé à 95 °C pendant 1 h. Couvrez les tubes de verre avec du papier d’aluminium pour éviter la condensation au sommet des tubes.
7. Retirez les tubes de verre du bloc chauffant et incubez sur de la glace pendant 30 min.
8. Centrifugeuse d’échantillons et d’étalons à 1500 x g pendant 10 min à 4 °C. Après la centrifugation, conserver les tubes en verre contenant les échantillons et les étalons à RT.
   note: Le fait de garder les échantillons sur de la glace ou à une température de 4 °C entraînera la précipitation de la totalité de l’échantillon ou de l’étalon.
9. Immédiatement après la centrifugation, aliquote 150 μL de surnageant de chaque tube et les placer dans un puits séparé d’une plaque de 96 puits.
10. Retirez les bulles de chaque puits à l’aide d’une pointe de pipette.
    note: La présence de bulles donnera des lectures d’absorbance incohérentes, ce qui entraînera une grande imprécision du dosage.
11. Absorbances de lecture à 532 nm. Soustrayez la lecture d’absorbance moyenne des échantillons à blanc de toutes les autres lectures d’absorbance.
12. Créez une courbe standard en traçant les lectures d’absorbance soustraites à blanc à 532 nm en fonction de la concentration connue de chaque étalon. Ajustez les points de données à l’aide de la régression linéaire. Calculez des concentrations d’échantillon inconnues à l’aide de l’équation de la droite de régression linéaire obtenue à partir de la courbe standard.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1x PBS stérile pH 7,4 1 L	VWR, Pennsylvanie	101642--262	Réactif de lyse cellulaire
Tube à centrifuger autoportant de 50 mL	Corning, État de New York	CLS430897	Matériel général
Plaque à 96 puits, non traitée, transparente, avec couvercle, non stérile	Thermo Fisher Scientific, Massachusetts	280895	Pour mesurer l’absorbance
Dispositif de filtre centrifuge à rotation Amicon Ultra-0.5 100 kD	Fisher Scientific, NH	UFC510024	Purification des LDL
Capuchons pour tubes en verre	Thermo Fisher Scientific, Massachusetts	14-930-15D	Pour le dosage TBARS
Chlorure de cuivre II	SIGMA, MO	Référence 222011-250G	Pour induire l’oxydation
Tubes de culture, jetables, avec finition à vis, verre borosilicaté (13 x 100 mm)	VWR, Pennsylvanie	Référence 53283-800	Pour le dosage TBARS
Milieu essentiel minimum d'Eagle (EMEM)	ATCC, Virginie	Réf. HB-8065	Milieux cellulaires de l’hépatite G2
Eppendorf Tubes Safe-Lock, 1,5 mL	eppendorf, État de New York	22363204	Matériel général
Eppendorf Tubes Safe-Lock, 2,0 mL	Genesee Sceitific, Californie	22363352	Matériel général
Sérum fœtal bovin US Source	Omega Scientific, Californie	FB-11	Pour la culture cellulaire
Acide acétique glacial	SIGMA, MO	27225-1L-R	Réactif TBARS
Cocktail d’inhibiteurs de protéase Halt (100x)	Thermo Scientific, MA	Référence 87786	Réactif de lyse cellulaire
HEPES	SIGMA, MO	H3375-250G	Solvant LDL
Acide chlorhydrique (HCl)	Fisher Scientific, NH	N° A144-212	Réactif de lyse cellulaire
Legend Micro 17 Centrifugeuse	Thermo Scientific, MA	75002431	Matériel général
Lipoprotéines de basse densité, plasma humain	Recherche et technologie d’Athènes, GA	Référence : 16-12-120412	Prototype de matrice biologique
Barres d’agitation magnétiques, Octogonne 6-assortiment	VWR, Pennsylvanie	Référence 58948-025	Matériel général
Malondialdéhyde bis (diméthylacétal)	SIGMA, MO	8207560250	Norme TBARS
Spectrophotomètre de microplaques Multiskan Go	Fisher Scientific, NH	51119200	Pour mesurer l’absorbance
NP-40	EMD Millipore Corp, Massachusetts	Réf. 492016-100ML	Réactif de lyse cellulaire
chlorure de sodium	SIGMA, MO	S7653-1KG	Réactif de lyse cellulaire
Dodécylsulfate de sodium (FDS)	SIGMA, MO	Réf. 436143-100G	Réactif TBARS
hydroxyde de sodium	SIGMA, MO	367176-2.5KG	Réactif TBARS
Concentrateur SpeedVac	Thermo Scientific, MA	SC250EXP	Pour la concentration des lysats cellulaires
Acide thiobarbiturique	SIGMA, MO	T5500-100G	Réactif TBARS
Base TRIS	Fluka, Géorgie	Référence 93362	Réactif de lyse cellulaire