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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation
- Ajouter 5 mL de pénicilline/streptomycine (10000 U/mL) et 5 mL et 10 mL de suppléments disponibles dans le commerce à 500 mL de milieu classique complet avec sérum. Aliquote 50 mL du milieu initialement.
note: Ne renvoyez aucun support dans le stock pour éviter toute contamination.
- Mettez une aliquote du milieu classique complet sur de la glace.
- Utilisez de l’éthanol à 70 % pour nettoyer le microscope de dissection, la pince et les ciseaux.
- Préparez deux boîtes de culture cellulaire (10 cm), l’une sur le microscope de dissection et l’autre sur de la glace ; mettez 10 ml de milieu classique complet dans chaque boîte.
2. Étapes expérimentales (Figure 1)
- Sacrifiez des souris C57BL/6J autour de la période postnatale (P) 20 en utilisant 75-100 mg/kg de kétamine et 7,5-10 mg/kg de xylazine injectée par voie intrapéritonéale. Garder les yeux en milieu classique complet sur glace avant la dissection.
- Enlever le tissu conjonctif (muscle et tissu adipeux) et le nerf optique de l’œil.
- À l’aide d’un micro-ciseau, coupez circonférentiellement 0,5 mm en arrière du limbe cornéen. Retirez le complexe cornée/iris, le vitré et le cristallin.
- Faites une incision de 1 mm perpendiculaire au bord coupé vers le nerf optique et coupez une bande circonférentielle de 1 mm de largeur. Séparez les régions centrales et périphériques du complexe. Utilisez une pince pour décoller la rétine du complexe EPR/choroïde/sclérotique.
- Conservez la bande choroïde périphérique dans un milieu classique complet sur de la glace ; isolez l’autre œil et répétez le processus pour couper une deuxième bande.
- Coupez la bande circulaire en 6 ~ morceaux carrés égaux (~1 mm x 1 mm).
note: Ne touchez jamais aucun bord.
- Décongeler l'extrait de membrane basale (BME) selon les instructions du fabricant. Ajouter 30 μL/puits de BME au centre de chaque puits d’une plaque de culture tissulaire de 24 puits. Assurez-vous que la gouttelette de BME forme un dôme convexe au bas de la plaque sans toucher les bords.
note: Décongelez le BME pendant une nuit au réfrigérateur. BME devrait être sur la glace à tout moment après la décongélation.
- Placez le tissu au milieu du BME.
note: N’aplatissez pas l’explant choroïde ; généralement, laissez le tissu se dilater à l’intérieur de l’EMO. L’orientation du tissu (côté scléral vers le haut ou vers le bas) n’a pas d’impact sur le résultat de l’expérience.
- Incuber la plaque à 37 °C pendant 10 min pour laisser le gel se solidifier.
- Ajouter 500 μL du milieu/puits classique complet.
- Changez le milieu classique tous les deux jours (500 μL). La germination de la choroïde peut être observée après 3 jours au microscope.
note: Pour le traitement par facteur de croissance, affamez le tissu pendant 4 h. Diluez un composé d’essai dans un milieu à facteur de croissance réduit (1:200 au lieu de 1:50).
3. Méthode de quantification informatisée SWIFT-Choroid (Figure 2)
NOTE : Une méthode informatisée a été utilisée pour mesurer la zone couverte par les récipients en croissance. Un plug-in de macro vers le logiciel ImageJ est nécessaire avant la quantification.
- Ouvrez l’image de germination de la choroïde avec ImageJ et cochez "Image |Type| 8 bits" avec niveaux de gris.
- Allez dans "Image | Ajuster | Luminosité/Contraste (Ctrl/Maj/C)" et optimisez le contraste.
- Utilisez la fonction de la baguette magique pour délimiter et retirer de l’image le tissu choroïde présent au centre des pousses (à l’aide de la touche de raccourci « F1 ») (Figure 2A, B).
note: Réglez le taux de tolérance de la baguette magique à 20-30 %.
- Supprimez l’arrière-plan de l’image à l’aide des outils de sélection libre (Figure 2C). Allez dans "Image | Ajuster | Seuil (Ctrl/Maj/T)". Utilisez la fonction de seuil pour définir les pousses microvasculaires par rapport à l’arrière-plan et à la périphérie (Figure 2D).
- Cliquez sur « F2 » et un résumé apparaîtra. Enregistrez une image de la zone sélectionnée en cliquant sur « Enregistrer ». Enregistrez-le dans le même dossier que l’image d’origine pour référence future.
- Une fois qu’un groupe d’échantillons a été mesuré, copiez l’enregistrement pour l’analyse des données.
note: Il est également possible de mesurer la surface (μm²) en "Analyser | Définir l’échelle" à l’aide d’images avec des barres d’échelle.
