Dosage de l’activité récepteur-rapporteur d’œstrogène pour cribler l’activité œstrogénique des phytoestrogènes

Abstract

Source : Fender, E. et al., Dépistage des phytoestrogènes à l’aide d’un test de récepteur β rapporteur d’œstrogène basé sur des cellules. J. Vis. Exp. (2021).

Cette vidéo décrit un test de rapporteur cellulaire pour déterminer l’activité œstrogénique de composés d’origine végétale. Un composé ayant une activité semblable à celle des œstrogènes imite sa liaison aux récepteurs d’œstrogènes et entraîne la transcription en aval des gènes de l’enzyme rapporteure. L’enzyme rapporteure génère une bioluminescence dans une réaction, indiquant l’activité œstrogénique du composé.

Protocol

1. Récepteur β transfection des œstrogènes humains

REMARQUE : Une technique aseptique et une hotte à flux laminaire sont requises pour le jour 1 du protocole de test.

1. Préparer des dilutions de 17β-œstradiol pour la courbe standard.
   1. Transférez le milieu de récupération cellulaire et le milieu de criblage composé (CSM) du congélateur et décongelez-les dans un bain-marie à 37 °C.
   2. Étiquetez les tubes de microcentrifugation intermédiaires 1 et 2 (INT1, INT2) et 1-8.
   3. Remplissez INT1 avec 995 μL de CSM, INT2 avec 615 μL de CSM, le tube 1 avec 900 μL de CSM et les tubes 2 à 8 avec 600 μ....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pipette de 1000 μL
Pipette de 20 μL
Pipette de 200 μL
Bain-marie à 37 °C
37 °C, incubateur humidifié à 5 % de CO2
70 % d’éthanol
Balance analytique
Hotte à flux laminaire conforme à la culture cellulaire
Diméthylsulfoxyde
Bac à milieux jetables, stérile
Système de filtration goutte à goutte
Erlenmeyer			125 mL et 250 mL
Méthanol de qualité HPLC
Système de dosage du rapporteur ERβ humain, 1 x 96 puits	Indigo Biosciences	IB00411	Kit de dosage - analyse 24 échantillons plus une courbe standard
Lyophilisateur
Pipette multicanaux
Agitateur orbital
Luminomètre à lecture de plaques			ex. Bioteck Synergy HTX
Évaporateur rotatif
Fioles à fond rond			50 mL et 300 mL
Tubes de microcentrifugation stériles ou bassins de milieux multicanaux stériles
Embouts stériles			200 μL et 1000 μL
Papier Whatman grade 1
Sacs Whirl-pak			sacs stériles en polyéthylène