Dosage de l’activité récepteur-rapporteur d’œstrogène pour cribler l’activité œstrogénique des phytoestrogènes

Résumé

Source : Fender, E. et al., Dépistage des phytoestrogènes à l’aide d’un test de récepteur β rapporteur d’œstrogène basé sur des cellules. J. Vis. Exp. (2021).

Cette vidéo décrit un test de rapporteur cellulaire pour déterminer l’activité œstrogénique de composés d’origine végétale. Un composé ayant une activité semblable à celle des œstrogènes imite sa liaison aux récepteurs d’œstrogènes et entraîne la transcription en aval des gènes de l’enzyme rapporteure. L’enzyme rapporteure génère une bioluminescence dans une réaction, indiquant l’activité œstrogénique du composé.

Protocole

1. Récepteur β transfection des œstrogènes humains

REMARQUE : Une technique aseptique et une hotte à flux laminaire sont requises pour le jour 1 du protocole de test.

1. Préparer des dilutions de 17β-œstradiol pour la courbe standard.
   1. Transférez le milieu de récupération cellulaire et le milieu de criblage composé (CSM) du congélateur et décongelez-les dans un bain-marie à 37 °C.
   2. Étiquetez les tubes de microcentrifugation intermédiaires 1 et 2 (INT1, INT2) et 1-8.
   3. Remplissez INT1 avec 995 μL de CSM, INT2 avec 615 μL de CSM, le tube 1 avec 900 μL de CSM et les tubes 2 à 8 avec 600 μL de CSM. Mettez le tube 8 de côté.
   4. Transférer 5 μL de 100 μM de 17β-œstradiol dans INT1. Jetez l’embout. Tourbillon.
   5. Avant chaque transfert, rincez 3 fois la pipette, puis transférez 10 μL de INT1 dans INT2. Jetez l’embout.
   6. Rincez la pipette 3 fois, puis transférez 100 μL de INT2 dans le tube 1. Jeter l’embout. Transférez 300 μL du tube 1 dans le tube 2. Répétez l’opération pour les tubes 3 à 7. Jetez 300 μL du tube 7 dans le conteneur à déchets. Le tube 8 est un Zéro et ne reçoit pas d’œstradiol. Les concentrations finales des étalons en plaques sont les suivantes : 400, 133,3, 44,44, 14,815, 4,938, 1,646, 0,5487 et 0 pM d’œstradiol.
2. Préparez des échantillons de composés.
   1. Échantillons de vortex.
   2. Prélever 4 μL de chaque échantillon de plante dans du DMSO et l’ajouter à 496 μL de CSM pour obtenir une solution de DMSO à 0,8 %.
3. Décongelez rapidement les cellules rapporteures.
   1. Récupérez le tube de milieu de récupération cellulaire du bain-marie à 37 °C. Désinfectez la surface extérieure avec de l’éthanol à 70 %.
   2. Récupérez les cellules rapporteures d’un stockage à -80 °C et décongelez-les en transférant 10 ml de CRM préchauffé dans le tube de cellules congelées.
   3. Fermez le tube des cellules rapporteures et transférez-les dans un bain-marie à 37°C pendant 5 à 10 minutes.
   4. Récupérez le tube de suspension de cellule rapporteure du bain-marie. Retournez doucement le tube de cellules plusieurs fois pour briser les agrégats de cellules et produire une suspension homogène. Nettoyez la surface du tube avec de l’éthanol à 70 %.
4. Dosage du placage.
   1. Versez 100 μL de suspension de cellule rapporteure dans chaque puits à l’aide d’une pipette multicanaux.
   2. Distribuer 100 μL d’échantillons en trois exemplaires dans les puits d’analyse appropriés.
   3. Transvasez la plaque dans un incubateur humidifié à 37 °C à 5 % de CO₂ pendant 22 à 24 h.
Substrat de
5. détection de décongélation et tampon de détection dans un réfrigérateur sombre pendant la nuit pour se préparer au jour 2.
6. Juste avant la fin de l’incubation de la plaque, retirez le substrat de détection et le tampon de détection du réfrigérateur et placez-les dans un endroit peu éclairé jusqu’à ce qu’ils soient équilibrés pour la RT. Une fois à RT, retournez doucement chaque tube plusieurs fois pour bien mélanger les solutions.
   1. Immédiatement avant la fin de l’incubation, versez tout le contenu du tampon de détection dans le tube du substrat de détection pour créer le réactif de détection de la luciférase. Mélangez doucement pour ne pas produire de mousse.
   2. Une fois l’incubation terminée, retournez la plaque pour jeter le contenu dans un récipient à déchets approprié. Tapotez doucement la plaque sur une serviette en papier absorbante propre pour éliminer les dernières gouttelettes des puits.
   3. Ajouter 100 μL de réactif de détection de la luciférase dans chaque puits. Laisser reposer la plaque de dosage à RT pendant 15 min. Ne secouez pas la plaque.
7. Quantifiez la luminescence à l’aide d’un luminomètre à lecture de plaques à 96 puits.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Pipette de 1000 μL
Pipette de 20 μL
Pipette de 200 μL
Bain-marie à 37 °C
37 °C, incubateur humidifié à 5 % de CO2
70 % d’éthanol
Balance analytique
Hotte à flux laminaire conforme à la culture cellulaire
Diméthylsulfoxyde
Bac à milieux jetables, stérile
Système de filtration goutte à goutte
Erlenmeyer			125 mL et 250 mL
Méthanol de qualité HPLC
Système de dosage du rapporteur ERβ humain, 1 x 96 puits	Indigo Biosciences	IB00411	Kit de dosage - analyse 24 échantillons plus une courbe standard
Lyophilisateur
Pipette multicanaux
Agitateur orbital
Luminomètre à lecture de plaques			ex. Bioteck Synergy HTX
Évaporateur rotatif
Fioles à fond rond			50 mL et 300 mL
Tubes de microcentrifugation stériles ou bassins de milieux multicanaux stériles
Embouts stériles			200 μL et 1000 μL
Papier Whatman grade 1
Sacs Whirl-pak			sacs stériles en polyéthylène