Transfert d’énergie par résonance de Forster résolu dans le temps pour la surveillance de la phosphorylation des protéines dans les cellules

Résumé

Source : Padros, J. et al., Essais de transfert d’énergie de résonance de Förster résolus en temps pour la mesure des protéines STAT phosphorylées endogènes dans les cellules humaines. J. Vis. Exp. (2021).

Cette vidéo décrit le test de transfert d’énergie par résonance de Förster ou TR-FRET résolu en temps pour déterminer la phosphorylation d’une protéine endogène à l’aide de fluorophores donneurs et accepteurs marqués sur des anticorps spécifiques à une protéine testée. Cette technique est conçue pour mesurer la phosphorylation des protéines testées dans les lysats cellulaires.

Protocole

1. Culture cellulaire

1. Maintenir les cellules dans un incubateur humidifié à 37 °C/5 % de CO₂ et les cultiver soit avec du DMEM complété par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) (cellules HeLa et A431), soit avec du RPMI complété par 15 % de FBS (cellules U266B1). Cultivez les cellules jusqu’à ce qu’elles atteignent 70-80 % de confluence, puis trypsinisez-les et passez-les ou utilisez-les pour les tests.
   note: Les milieux de culture contenaient du rouge de phénol. Aucune famine sérique n’a été réalisée pour aucune lignée cellulaire avant la réalisation des essais.

2. Titrage du stimulateur ou ....

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Microplaque à 96 puits, transparente, à fond plat, polystyrène, traitée par culture tissulaire, stérile	Corning	Référence 3595	Il s’agit de la plaque de culture des cellules lors de l’utilisation du protocole d’essai à deux plaques. D’autres plaques de culture cellulaire à 96 puits peuvent être utilisées
Microplaque 384 puits, blanche, faible volume	PerkinElmer	6007290	Il s’agit de la plaque pour la détection TR-FRET lors de l’utilisation des protocoles de dosage à deux ou une plaques. D’autres plaques blanches à 384 puits de faible volume peuvent être utilisées
Lignée cellulaire A431	ATCC	CRL-1555
Joint adhésif pour microplaques	PerkinElmer	6050185
Milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM)	bison d’europe	Référence 319-005-CL	THUNDER TR-FRET est compatible avec les milieux de culture contenant du rouge de phénol
Lecteur de plaques multi-étiquettes EnVision Xcite	PerkinElmer	Référence 2104-0020A	Les dosages peuvent être effectués sur une variété de lecteurs de plaques équipés de l’option TR-FRET
Lignée cellulaire HeLa	ATCC	CCL-2
Roswell Park Memorial Institute 1640 moyen (RPMI)	bison d’europe	Référence 350-007-CL	THUNDER TR-FRET est compatible avec les milieux de culture contenant du rouge de phénol
Trypsine/EDTA 0,05 %	bison d’europe	325-542-CL
Eau ultra-pure	Na	Na	Utilisez de l’eau de qualité Milli-Q (18 MΩ.cm) pour diluer le tampon de lyse et le tampon de détection