Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local
1. Isolement et culture de cellules progénitrices neurales humaines (hNPCs)
- Placez le tissu cérébral dans une boîte de Pétri de 100 mm et retirez soigneusement les méninges à l’aide d’une pince.
- Transférez le tissu cérébral dans un tube conique de 50 ml et lavez-le deux fois avec 20 ml de PBS en inversant doucement le tube.
- Incuber le tissu cérébral dans un nouveau tube conique de 50 mL en immergeant le tissu dans une solution de dissociation cellulaire (voir le tableau des matières) et dans de la DNase I (10 U/mL) pendant 10 min à 37 °C.
- Ajouter 5 mL de milieu de culture de cellules neuronales (voir la table des matières) dans le tube contenant du tissu cérébral et dissocier mécaniquement les neurosphères en triturant 20 à 30 fois à travers une pointe de pipette de 1000 μL pour former une suspension unicellulaire.
- Filtrez la suspension cellulaire à travers une crépine de 70 μm pour éliminer les amas de cellules.
- Ensemencer la suspension unicellulaire dans une fiole T-25 ventilée avec 5 à 10 mL de milieu de culture de cellules neuronales complété par les composants détaillés dans le tableau 1.
- Stériliser la solution d’héparine par filtration à travers un filtre de 0,2 μm. Le supplément B-27 sans vitamine A est un complément sans sérum pour la culture des progéniteurs neuraux et des cellules souches sans induire de différenciation.
note: Les cellules progénitrices neurales humaines (hNPC) sont isolées à partir d’un cerveau fœtal humain prélevé sur un fœtus avorté. Après 7 à 10 jours de culture, les cellules souches neurales (NSC) forment des colonies de neurosphères flottantes, tandis que d’autres types de cellules restent en suspension sous forme de cellules uniques ou se fixent au fond du flacon. Les hNPCs isolés peuvent être cultivés sous forme de neurosphères en suspension pendant plusieurs mois.
2. Passage des hNPCs
- Recueillir le milieu contenant les sphères flottantes, grandes et petites neurosphères, et les transférer dans un tube conique de 50 ml.
note: Pour des raisons inconnues, le moment de la division des neurosphères varie de 7 jours à 30 jours. Cependant, en général, les neurosphères doivent être traversées lorsqu’elles atteignent un diamètre supérieur à 700-900 μm. C’est à ce moment-là que le centre de la neurosphère commence à s’assombrir, ce qui est considéré comme le signe d’un taux élevé de mort cellulaire.
- Faites tourner les neurosphères par centrifugation à 300-400 x g pendant 3 min.
- Aspirez soigneusement le surnageant, puis immergez les sphères dans 500 μL de réactif de dissociation cellulaire décongelé (voir le tableau des matériaux).
- Faites des aliquotes du réactif de dissociation cellulaire en ajoutant 500 μL par microtubes de 1,5 mL et conservez-les à -20 °C. Pour éviter de perdre l’activité enzymatique, décongelez le réactif de dissociation cellulaire en le maintenant à RT ou à chaud pendant 5 min dans un bain d’eau/bille à 37 °C.
- En fonction de la densité et de la taille des sphères, incubez les sphères immergées à 37 °C pendant 5 à 15 min.
- Ajouter 5 à 10 mL de milieu de culture préchauffé dans les neurosphères contenant un tube conique de 50 mL et centrifuger à 300-400 x g pendant 5 min pour sédimenter les neurosphères.
- Aspirer le surnageant et pipeter doucement de haut en bas, à l’aide d’une pipette de 1000 μL, dans 2 mL de milieu de culture jusqu’à ce que toutes les neurosphères soient dans une suspension unicellulaire.
note: La dissociation deviendra visible à l’œil nu. Avant la dissociation, les neurosphères se présentent sous la forme de sphères. Après immersion dans le réactif de dissociation et par pipetage de haut en bas, ils deviendront des cellules uniques.
- Compter et mettre en plaques les cellules individuelles, soit 2 à 3 millions de cellules par fiole T-25, dans 10 mL de milieu de culture.
- Nourrissez les cellules tous les 3 jours en remplaçant la moitié du milieu de culture.
- Installez les neurosphères en penchant le flacon de manière à ce qu’il soit dans son coin inférieur. Maintenez le ballon en position pendant environ 1 à 2 minutes jusqu’à ce que les neurosphères se sédimentent. Ensuite, aspirez doucement la moitié du milieu en insérant la pipette sérologique dans le milieu au-dessus des neurosphères installées. Les cellules dissociées peuvent s’agréger pour former des sphères après 2 à 3 jours de culture.
3. Congélation des hNPCs
- Préparez le milieu de congélation cellulaire en ajoutant du DMSO au milieu de culture jusqu’à une concentration finale de 10 % (v/v) ou utilisez un milieu de cryoconservation disponible dans le commerce pour les types de cellules sensibles (voir le tableau des matériaux).
- Triez les grosses sphères en transférant le support dans un tube conique de 50 ml et en laissant les sphères se déposer par gravité. Ensuite, retirez et transférez les grandes neurosphères dans un nouveau tube conique de 50 mL pour le passage à l’aide d’une pointe de pipette de 200 ou 1000 μL.
note: Les neurosphères d’un diamètre supérieur à 900 μm sont considérées comme grandes, et celles d’un diamètre inférieur à 500 μm sont considérées comme petites.
- Faites tourner les neurosphères restantes par centrifugation à 300-400 x g pendant 3 min. Retirez délicatement le surnageant.
- Remettez en suspension jusqu’à 100 sphères dans 1 mL de réactif de cryoconservation et transférez-les dans un cryotube.
- Conserver une nuit à -80 °C dans un récipient de congélation cellulaire (voir le tableau des matériaux) et le transférer à l’azote liquide le lendemain pour un stockage à long terme.
note: Il est préférable de congeler des neurosphères de petite à moyenne taille (moins de 900 m de diamètre) et d’éviter de congeler des neurosphères de grande taille (de plus de 900 m de diamètre) ou des cellules individuelles. Afin de réduire les dommages cellulaires lors de la décongélation de l’échantillon, maintenez les cellules denses en ensemenceant les neurosphères décongelées dans une petite fiole T25.
4. Évaluation de la neurotoxicité
REMARQUE : La cytotoxicité des composés d’essai est évaluée sur des plaques de 384 puits (voir le tableau des matériaux) à l’aide d’un test de viabilité cellulaire luminescente (voir le tableau des matériaux). Les hNPCs sont préparés selon la même méthode, à l’exception de légères modifications, décrite dans la section « Différenciation et traitement des hNPC ». Par la suite, un signal luminescent généré par le test de viabilité cellulaire luminescente est mesuré à l’aide d’un lecteur de microplaques. Le signal luminescent est proportionnel à la concentration cellulaire d’ATP, qui elle-même est directement proportionnelle au nombre de cellules viables présentes dans chaque puits.
- revêtement
- Ajouter 30 μL de poly-L-lysine (PLL) par puits d’une plaque de 384 puits.
- Incuber pendant 1 h à RT.
- Laver 2x avec du PBS.
- Laissez sécher à RT (pendant environ 30 min).
- Ajouter 30 μL de laminine (50 μg/mL) par puits d’une plaque de 384 puits.
- Incuber pendant 2 h à 37 °C.
- Laver 2 fois avec PBS.
note: Les plaques revêtues à 384 puits peuvent être stockées à 4 °C pendant 1 mois.
- Placage des cellules
- Compter et mettre en plaque 20 000 neurosphères unicellulaires par puits d’une plaque de 384 puits dans 25 μL de milieux de différenciation.
- Incuber pendant 5 jours à 37 °C.
- Après 5 jours, traiter les cellules pendant 24 h à l’aide de composés d’essai préparés à 6 fois la concentration finale souhaitée dans un volume de 5 μL (pour obtenir un volume final de 30 μL par puits).
- Essai de viabilité cellulaire
- Ajouter 30 μL de réactif de test de viabilité cellulaire luminescent par puits d’une plaque de 384 puits.
note: Ajouter un volume de réactif de test de viabilité cellulaire luminescente égal au volume présent dans chaque puits. Décongelez le réactif d’essai de viabilité cellulaire luminescente et équilibrez-le en RT avant de l’utiliser.
- Agiter sur une plaque agitée pendant 2 minutes (pour mélanger et induire la lyse cellulaire).
- Essorage du mélange par centrifugation à 300-400 x g pendant 30 s.
- Incuber la plaque de 384 puits pendant 10 min à RT dans un endroit à l’abri de la lumière (pour stabiliser le signal luminescent).
- Enregistrez la luminescence avec un lecteur de microplaques.
note: Utiliser des témoins appropriés pour l’essai de viabilité, y compris Velcade (à une concentration finale de 10 μM) comme témoin positif et HBSS contenant du DMSO (avec une concentration finale de 0,1 % ou 0,2 %) comme témoin négatif.
Tableau 1. Composants nécessaires à la fabrication de 100 mL de milieu de culture
| quantité | composant |
| 100 μL | EGF (20 ng/mL) |
| 100 μL | FGF (10 ng/mL) |
| 2 mL | B-27, moins la vitamine A (50X) |
| 1 mL | L-alanyl-L-glutamine (100X) (voir tableau des matériaux) |
| 4 μL | Héparine (2 μg/mL) |
| 96,8 ml | Milieu de culture de cellules neuronales (voir tableau des matériaux) |
