Essai de complémentation de la luciférase fractionnée pour identifier des interactions protéine-protéine spécifiques

Abstract

Source : Wiertelak, W. et.al., Démonstration de complexes hétérologues formés par des protéines membranaires de type III résidentes de Golgi à l’aide d’un essai de complémentation de la luciférase divisée. J. Vis. Exp. (2020)

Cette vidéo montre le test de complémentation de la luciférase fractionnée pour détecter les interactions protéine-protéine. Dans cet essai, les protéines d’intérêt sont associées à de petits et de grands fragments de l’enzyme luciférase. Lorsque les protéines interagissent, les grands et les petits fragments se combinent pour former un complexe enzymatique actif, qui, en présence d’un substrat spécifique, libère une luminescence brillante qui peut être mesurée.

Protocol

1. Transfection transitoire des plasmides d’expression dans les cellules

1. Récoltez l’adhérent HEK293T culture cellulaire par trypsinisation et remettez les cellules en suspension dans un milieu de croissance complet dédié. Déposer les cellules (2 x 10⁴/100 μL/puits) sur une plaque à 96 puits à fond transparent et à flanc blanc. Ajustez le nombre total de puits pour tenir compte de toutes les combinaisons et de tous les contrôles testés, y compris les réplications.
   note: Essayez d’utiliser uniquement les 60 puits intérieurs de la plaque pour minimiser les changements thermiques et éviter l’évaporation pendant la nuit. L’utilisation de plaques revêtues de poly-D-lysine est fortement recommandée, comme celles indiquées dans le tableau des matériaux, sinon les cellules peuvent se détacher au cours des étapes de lavage suivantes.
2. Cultivez les cellules pendant la nuit dans des conditions standard (37 °C, 5 % de CO₂).
3. Le lendemain, transfectez les cellules avec les combinaisons souhaitées de plasmides d’expression.
   1. Diluer les plasmides d’expression dans un milieu exempt de sérum (voir le tableau des matériaux) à 6,25 ng/μL pour chaque construction.
   2. Ajouter le réactif de transfection à base de lipides à un rapport lipide/ADN approprié et incuber selon les instructions du fabricant.
   3. Ajouter 8 μL de mélange lipide/ADN dans les puits désignés. Mélangez le contenu de la plaque par rotation douce. Il en résulte la transfection des deux constructions d’expression à 50 ng/puits.
4. Cultivez les cellules pendant 20 à 24 h dans des conditions standard (37 °C, 5 % CO₂).
   note: La culture des cellules pendant une période plus longue peut entraîner des niveaux plus élevés d’expression de la protéine de fusion, ce qui peut favoriser une association non spécifique entre les fragments.

2. Échange moyen

1. Le lendemain, remplacez le milieu conditionné par 100 μL d’un milieu sans sérum dans chaque puits. Assurez-vous que les cellules ne se sont pas détachées lors de l’échange de fluide.
   note: Cette étape doit être effectuée 2-3 h avant l’ajout de la solution de travail de furimazine. Le retrait sérique minimise le bruit de fond causé par l’autoluminescence de la furimazine.

3. Préparation de la solution de travail de la furimazine

1. Juste avant la mesure, mélanger 1 volume de furimazine avec 19 volumes d’un tampon de dilution (une dilution de 20 fois).
   note: Le volume total de la solution de travail de furimazine à préparer dépend du nombre de puits individuels à analyser (la solution de travail de furimazine est ajoutée au milieu de culture cellulaire dans un rapport de 1:5, par conséquent, à chaque puits préalablement rempli de 100 μL d’un milieu sans sérum, 25 μL de la solution de travail de furimazine doivent être ajoutés).
2. Ajouter la solution de travail de furimazine dans les puits désignés (25 μL/puits). Mélangez délicatement la plaque à la main ou à l’aide d’un agitateur orbital (par exemple, 15 s à 300-500 tr/min).

4. Mesure de la luminescence

1. Insérez la plaque dans un lecteur de microplaques à luminescence.
   1. Pour les expériences qui doivent être effectuées à 37 °C, équilibrez la plaque pendant 10 à 15 minutes à la température indiquée.
2. Sélectionnez les puits à analyser.
3. Lecture de la luminescence avec un temps d’intégration de 0,3 s. Continuez à surveiller la luminescence jusqu’à 2 h si nécessaire.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solution de trypsine-EDTA à 0,25 %			Culture cellulaire
Lignée cellulaire de mammifère adhérente			Culture cellulaire
Microplaque BioCoat Poly-D-Lysine 96 puits blanche/transparente à fond plat traitée TC, avec couvercle	Corning	356651	Articles en plastique
Centrifugeuse de culture cellulaire			Articles en plastique
Suppléments de culture cellulaire (sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur, L-glutamine, pénicilline, streptomycine)			Culture cellulaire
Incubateur à CO2			appareil
Plasmides d’expression codant pour des protéines d’intérêt non marqués avec des fragments NanoBiT			Test
Réactif de transfection FuGENE HD	Promega	E2311	Test
Lecteur de microplaques GloMax Discover (ou un autre lecteur de microplaques à luminescence)	Promega	Réf. GM3000	appareil
Milieu de culture dédié à la lignée cellulaire utilisée			Culture cellulaire
Matériaux et réactifs pour le clonage moléculaire standard (bactéries, polymérase thermostable, enzymes de restriction, ADN ligase, matériaux et réactifs pour la purification des acides nucléiques)			Test
Système de démarrage NanoBiT MCS	Promega	N2014	Ce kit contient des vecteurs permettant de marquer les protéines d’intérêt avec des fragments de NanoBiT à différentes orientations ainsi que le plasmide de contrôle codant pour la protéine HaloTag fusionnée avec SmBiT et une paire de plasmides de contrôle positif.
Système de dosage de cellules vivantes Nano-Glo	Promega	N2011	Ce kit contient de la furimazine, qui est un substrat permettant de détecter l’activité de NanoLuc dans les cellules vivantes, et un tampon de dilution dédié.
Sérum Opti-MEM I Réduit en Médium, sans rouge de phénol	Gibco	11058021	Culture cellulaire
Agitateur orbital			appareil