Dosage par électrochimiluminescence pour la quantification des niveaux de protéines cibles dans le lysat cérébral

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE

1. Protocole MeCP2-ECLIA

1. Préparation de la solution de lavage, du tampon de blocage et de la solution de diluant d’essai (jour 1)
   1. Ajouter 500 μL de Tween 20 à 1 L de PBS pour préparer un Tween 20 à 0,05 % dans une solution de PBS, mélanger vigoureusement et étiqueter comme « solution de lavage ».
      note: Assurez-vous que seul un tampon de lavage fraîchement préparé est utilisé.
   2. Préparez une solution bloquante de 3 % de bloqueur A (table des matériaux) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Mélangez en remuant doucement, filtrez-les, stérilisez-les et conservez-les au réfrigérateur jusqu’à ce qu’ils soient utilisés pendant deux semaines maximum.
   3. Ajouter 5 mL de solution bloquante à 10 mL de PBS pour préparer une solution de diluant d’essai (bloqueur A à 1 % dans le PBS).
2. Revêtement de plaques à haute liaison
   1. Retirez une plaque à liaison élevée à un seul point multiréseau de 96 puits.
      note: Les plaques à liaison élevée ont une plus grande capacité de liaison et donc une plage dynamique plus large que les plaques standard à surface hydrophobe.
   2. Décongelez l’anticorps monoclonal de souris anti-MeCP2 sur de la glace et mélangez 0,67 μL de l’anticorps avec 4 ml de PBS (dilution de 1:6 000 d’anticorps dans le PBS). Vortex la solution d’anticorps pour bien mélanger et étiqueter le tube comme « solution d’enrobage ».
   3. Distribuer soigneusement 25 μL de solution d’enrobage dans le coin inférieur de chaque puits à l’aide d’un pipeteur multicanaux, c’est ce qu’on appelle la méthode d’enrobage de solution. Tapotez doucement la plaque à 96 puits de chaque côté pour vous assurer que la solution d’enrobage recouvre le fond de chaque puits.
   4. Scellez la plaque à l’aide d’un film adhésif et incubez la plaque au réfrigérateur à 4 °C pendant la nuit (12−16 h).
3. Blocage (jour 2)
   1. Sortez l’assiette du réfrigérateur et retirez le papier d’aluminium.
   2. Retirez la solution d’enrobage d’anticorps en la jetant dans la corbeille à papier et tapotez l’assiette sur une serviette en papier pour retirer toute la solution d’enrobage des puits.
   3. Ajouter 125 μL de solution de blocage par puits. Scellez à nouveau la plaque et placez-la sur un agitateur de microplaques orbital.
   4. Incuber la plaque pendant 90 min à température ambiante en secouant constamment à 800 tr/min.
4. Préparation des étalons et des échantillons
   1. Pendant la période d’incubation, préparez les étalons protéiques MeCP2 et/ou TAT-MeCP2 et divers échantillons.
      note: Le tampon de lyse utilisé pour la dilution standard doit être le même que celui utilisé dans les échantillons analysés.
   2. Sortez un flacon de solution mère de protéines MePC2 et/ou TAT-MeCP2 (250 μg/mL), de lysats de cerveau de souris et de lysats HDF à -80 °C. Décongelez-les sur de la glace.
   3. Diluer la solution mère étalon (MeCP2 et/ou TAT-MeCP2) dans des tubes propres conformément au tableau 1.
   4. Diluez les échantillons dans le tampon de lyse comme suit : 1−20 μg de lysat de cerveau de souris par 25 μL de tampon de lyse, et 0,25−1 μg de lysat HDF par 25 μL de tampon de lyse. Préparez un volume suffisant de chaque échantillon pour effectuer l’analyse en trois exemplaires.
5. Ajout des échantillons et des solutions standard
   1. Retirez la solution de blocage en la jetant dans la corbeille à papier et tapotez l’assiette sur une serviette en papier pour retirer toute la solution de blocage des puits.
   2. Lavez la plaque 3 fois avec 150 μL de solution de lavage en ajoutant la solution de lavage et en la retirant immédiatement.
   3. Ajoutez 25 ul d’étalons et d’échantillons dans le coin inférieur du puits à l’aide d’une pipette monocanal.
   4. Fermez la plaque et incubez la plaque pendant 4 h à température ambiante en secouant constamment à 800 tr/min.
6. Anticorps de détection non marqué
   1. Décongelez l’anticorps polyclonal de lapin anti-MeCP2 sur de la glace. Diluer l’anticorps 1:6 000 dans une solution de diluant de dosage.
   2. Retirez les étalons et les échantillons en les jetant dans la corbeille à papier et en tapotant l’assiette sur une serviette en papier.
   3. Lavez la plaque 3 fois avec 150 μL de solution de lavage en ajoutant la solution de lavage et en la retirant immédiatement.
   4. Ajoutez 25 μL d’anticorps de détection non marqué dans chaque puits à l’aide de la pipette multicanaux. Fermez la plaque et incubez-la pendant 1 h en secouant constamment à 800 tr/min à température ambiante.
7. Anticorps conjugués spécifiques
   1. Sortez l’anticorps secondaire spécifique (table des matériaux) du réfrigérateur et placez-le sur de la glace. Diluer l’anticorps 1:666.67 dans une solution de diluant de dosage et mélanger délicatement.
   2. Retirez l’anticorps secondaire libre non étiqueté en le jetant dans la corbeille à papier et en tapotant la plaque sur une serviette en papier.
   3. Lavez la plaque 3 fois avec 150 μL de solution de lavage en ajoutant la solution de lavage et en la retirant immédiatement.
   4. Ajoutez 25 μL d’anticorps conjugués spécifiques (tableau des matériaux) dans chaque puits à l’aide de la pipette multicanaux. Fermez la plaque et incubez pendant 1 h en agitant constamment à 800 tr/min à température ambiante.
8. Lire la planche
   1. Retirez l’anticorps conjugué libre (tableau des matériaux) en le jetant dans la corbeille à papier et tapotez l’assiette sur une serviette en papier.
   2. Lavez la plaque 3 fois avec 150 μL de solution de lavage.
   3. Ajoutez 150 μL de tampon de lecture Gold à base de Tris (tableau des matériaux) avec un tensioactif contenant de la tripropylamine comme coréactif pour la génération de lumière sur la plaque. Évitez les bulles d’air en utilisant des techniques de pipetage inversé.
   4. Placez la plaque sur la plate-forme de détection de microplaques (Table des matériaux) et commencez immédiatement la mesure. Utilisez les paramètres d’acquisition de plaques à 96 puits.
   5. Capturez les signaux d’électrochimiluminescence à l’aide d’une caméra CCD intégrée dans un système de détection d’électrochimiluminescence (Table des matériaux) et enregistrez le nombre de signaux, qui correspond à des unités de lumière relative (RLU) et est directement proportionnel à l’intensité de la lumière.
      note: Lors de la stimulation électrochimique, l’étiquette de ruthénium liée à l’électrode de carbone émet une lumière de luminescence à 620 nm. Analyser les données à l’aide du logiciel accompagné par l’instrument (Table of Materials).

Tableau 1 : Séries standard de 0 à 1 800 ng/mL.