1. Réactions DDPCR et préparation de génération de gouttelettes
- Quantifier l’ADN à l’aide d’un fluorimètre.
note: Pour le test de chute, il est recommandé d’utiliser une plage de 3 000 à 30 000 copies du génome haploïde par réaction, qui est conçue pour détecter les événements NHEJ avec une sonde de marquage HEX qui se lie à une séquence WT du site de coupe ciblé et ne recuit pas (chute) s’il y a une délétion ou une insertion au site cible, indiquant la présence d’un variant de la NHEJ.
- Calculez le nombre de copies à l’aide du poids du génome haploïde et de la concentration d’ADN dans l’extrait. Cela se fait en multipliant la concentration de l’ADN extrait par le volume utilisé pour obtenir la masse totale d’ADN, puis en la divisant par le poids du génome haploïde. Assurez-vous que le volume ajouté est compris entre 1 et 10 μL. Diluez si nécessaire pour être dans la plage de copies du génome haploïde recommandée.
note: On estime qu’un génome haploïde d’Anopheles gambiae est de 0,27 pg par moustique adulte.
- Concevez des amorces et des sondes. Concevez des amorces oligonucléotidiques directes et inverses avec une température de fusion de l'amorce (Tm) dans la plage de 55 à 60 °C qui flanquent les extrémités 5' et 3' du site cible de l'ARNg, produisant un amplicon de 150 à 400 pb.
- Sonde marquée HEX (hexachloro-fluorescéine) pour la détection NHEJ : Concevez un oligonucléotide de ~15-20 pb de longueur complémentaire au site cible et ajoutez la sonde HEX à l'extrémité 5' et BHQ1 (BLack Hole Quencher 1) à l'extrémité 3'. La Tm de la sonde d’hydrolyse doit être supérieure de 3 à 10 °C à la Tm des amorces.
- Sonde marquée FAM (6-carboxyfluorescéine) pour WT de référence : Concevez un oligonucléotide de ~15-20 pb de longueur complémentaire à un site génomique conservé éloigné (environ 25 pb) du site cible et ajoutez la sonde FAM à l'extrémité 5' et BHQ1 à l'extrémité 3'. La Tm de la sonde d’hydrolyse doit être supérieure de 3 à 10 °C à la Tm des amorces.
2. Préparation de la réaction PCR
- Préparez 25 μL du mélange d’échantillons ddPCR avec les composants suivants : supermix ddPCR pour sondes (sans UTP) : 12,5 μL, amorces avant et arrière (10 μM) : 1 μL chacune, sondes HEX/FAM (10 μM) : 0,625 μL chacune, ADN : 1-5 μL (3 750-37 500 copies du génome haploïde) et eau : jusqu’à 25 μL.
- Bien mélanger les réactions par vortex ou pipetage par reflux (haut et bas) (20x).
note: Si les réactions se produisent dans une plaque à 96 puits, pipetez tout le volume de haut en bas 20 fois plutôt que de faire un vortex pour éviter la formation de bulles.
- Centrifuger brièvement les échantillons pour déposer le mélange au fond du tube ou du puits.
note: Assurez-vous que les réactions sont à température ambiante pour la génération de gouttelettes. Préparez 1x de mélange ddPCR pour les puits supplémentaires/inutilisés dans chaque cartouche (chaque cartouche a 8 puits).
3. Génération de gouttelettes
- À l’aide d’une pipette multicanaux de 50 μL, chargez 20 μL du mélange d’échantillons ddPCR dans la rangée centrale de la cartouche (figure 1A, en haut).
- Chargez 70 μL d’huile dans la rangée inférieure. Chargez 20 μL de 1x supermix ddPCR dans les puits inutilisés.
note: N’introduisez pas de bulles.
- Placez le joint en ne touchant que les bords, en évitant la zone concave centrale (Figure 1B).
- Placez la plaque en toute sécurité dans le générateur de gouttelettes et fermez le couvercle pour commencer le cycle.
- À l’aide de la pipette multicanaux, transférez 40 μL du mélange d’émersion de la rangée supérieure de la cartouche (figure 1A, en bas) dans la plaque à 96 puits.
- Prélever l’échantillon de liquide pendant 3 à 5 s à un angle de 45 à 30°. Expulsez le mélange lentement pendant plus de 3 s à un angle de 45° sur le côté du puits, en le laissant s’égoutter sur le côté. Il est acceptable de passer au deuxième arrêt (expulsion complète) de la pipette pour expulser tout le liquide.
- À l’aide de thermosoudures en aluminium, souder les plaques pendant 5 s à 180 °C.
4. PCR
- Placez la plaque scellée dans le thermocycleur (Figure 1C) et réglez les conditions de PCR recommandées si vous suivez les directives de dépôt du NHEJ comme suit :
- Dénaturation initiale à 95 °C pendant 10 min.
- Réglez 40 cycles de 94 °C pendant 30 s pour la dénature, 55 °C pendant 1 min pour le recuit et 60 °C pendant 2 min pour l’extension.
- Maintenir à 98 °C pendant 10 min.
- Maintien à 4 °C.
note: La température de recuit pour des amorces et des jeux de sondes spécifiques peut être optimisée à l’aide d’un gradient thermique. Utilisez une rampe de 2 °C/s pour toutes les étapes. Les conditions de PCR doivent être ajustées en fonction de la conception et de la configuration de chaque expérience.
5. Lecture des gouttelettes
- Placez la plaque en toute sécurité dans le lecteur de gouttelettes avec le puits A-1 en haut à gauche (coin lissé, les trois autres sont bordés) (Figure 1D).
- Configurez la plaque dans le programme : Désignation de FAM comme canal de référence connu et HEX comme canal inconnu (Figure 2A).
- Exécutez l’expérience de lecture des gouttelettes en tant que quantification directe. Une fois l’exécution terminée, remplacez le type d’expérience par Drop-Off (DOF) pour l’analyse (Figure 2A).
