Réaction en chaîne par polymérase à gradient pour déterminer la température de recuit optimale

Résumé

Source : Tsujimoto, H. et al., Indel Détection suite à la mutagenèse CRISPR/Cas9 à l’aide de l’analyse de fonte à haute résolution chez le Mosquito Aedes aegypti. J. Vis. Exp. (2021).

Cette vidéo illustre la réaction en chaîne de la polymérase de gradient pour l’optimisation de la température de recuit des amorces, qui définit la température de recuit de gradient le long des puits. L’effet des différentes températures de recuit est déterminé par le rendement des produits amplifiés qui permet d’optimiser les conditions de réaction.

Protocole

1. Recherche de polymorphismes nucléotidiques simples (SNP), conception d’amorces HRMA et validation d’amorces

1. Identification des SNP chez les mules de laboratoire de type sauvage
   1. Sélectionnez l’exon cible pour perturber la traduction correcte des polypeptides.
      note: La cible doit être proche du codon de départ ou parmi les résidus clés nécessaires à la fonction protéique. Plus l’exon est court (par exemple, ≤200 bases), plus il est difficile à cibler et à analyser. Évitez de modifier près des limites d’un exon, car cela force l’une des amorces HRMA à traverser un intron ou à être dans un intron. Cela n’est pas souhaitable car les taux de SNP ont tendance à être beaucoup plus élevés dans ces régions.
   2. Conception de l’apprêt
      1. Allez sur le site Web NCBI Blast - Primer Blast, copiez et collez l’exon choisi dans la case en haut de la page | choisissez la taille du produit PCR (assurez-vous qu’elle englobe la majeure partie de l’exon) | choisissez l’organisme.
      2. Cliquez sur Paramètres avancés | Optez (pour PCR Product Tm) et ajoutez 60 (pour une température optimale de 60 °C) | Obtenez des amorces. Conservez les autres paramètres par défaut.
   3. Obtenir de l’ADN génomique (ADNg) à partir de la colonie de laboratoire de type sauvage. Mettez de côté 10 moustiques, anesthésiez-les avec du CO₂ et placez-les dans une boîte de Pétri sur de la glace pour les garder inactifs. Mettre en place 10 tubes contenant 0,5 μL du réactif de libération de l’ADN des tissus et 20 μL de tampon de dilution, tous deux fournis dans la trousse de libération de l’ADN suggérée dans la Table des matières.
   4. Retirez une patte d’un seul moustique à l’aide d’une pince et placez-la dans un tube correspondant d’une solution diluée du réactif de libération d’ADN (à l’étape 1.1.3), en immergeant complètement la jambe dans la solution. Répétez cette étape avec les moustiques restants, en essuyant la pince avec de l’éthanol à 70 % avant de passer à la suivante.
   5. Incuber la solution contenant la cuisse à température ambiante pendant 2 à 5 min, puis à 98 °C pendant 2 min, et laisser refroidir pendant la mise en place de la réaction PCR.
      note: Les plaques contenant l’ADNg libéré peuvent être stockées à -20 °C, et le protocole peut être mis en pause à ce stade.
   6. Préparez 10 tubes contenant 10 μL de 2x PCR Master Mix, des amorces à une concentration finale de 0,5 μM et de l’eau de qualité moléculaire jusqu’à un volume final de 20 μL, puis transférez 1 μL de l’échantillon dilué dans chaque tube. Effectuer la PCR en suivant ces paramètres de cycle : 98 °C 5 min, 40 cycles de 98 °C pendant 5 s, 60 °C 30 s, 72 °C 20 s par kb ; extension finale à 72 °C pendant 1 min.
   7. Purifier les produits PCR avec une enzyme pour dégrader les amorces PCR résiduelles et déphosphoryler les dNTP en excès ou tout kit de nettoyage de colonne. Procédez au séquençage des échantillons.
   8. Analysez chaque électrophérogramme pour détecter la présence de doubles pics/bases ambiguës, et ajustez manuellement les appels de base dans chaque séquence à l’aide du code de base dégénéré approprié.
      note: Cette étape doit être effectuée avant l’alignement de plusieurs séquences, car il est courant que le logiciel d’appel de base sélectionne le pic le plus proéminent comme le « vrai » appel de base, donnant la fausse impression d’une absence de SNP.
   9. Effectuez un alignement à séquences multiples à l’aide du logiciel d’alignement, SeqMan Pro, répertorié dans la Table des matériaux ou d’un autre logiciel d’alignement open source, tel que ClustalW ou T-Coffe.
      1. Ouvrez le logiciel d’alignement | cliquez sur Ajouter des séquences | sélectionnez les séquences souhaitées et cliquez sur Ajouter | Une fois toutes les séquences choisies, cliquez sur Terminé.
      2. Cliquez sur Assembler pour effectuer l’alignement. Pour ouvrir l’alignement, cliquez sur Contig 1 et analysez l’alignement et identifiez les SNP (Figure 1).
         note: Comme alternative aux étapes 1.1.3-1.1.6, la PCR peut être effectuée à partir d’ADN génomique isolé obtenu à partir d’échantillons en vrac (dérivés de >10 individus). Les amplicons séquencés peuvent être analysés directement pour détecter la présence de SNP apparaissant sous forme de doubles pics dans l’électrophérogramme, bien que les SNP rares soient plus difficiles à détecter.
   10. Concevoir 3 à 5 ARN guides simples (ARNsg), en évitant les régions contenant les SNP identifiés ci-dessus, en suivant le protocole décrit ci-dessous.

2. Conception de l’amorce HRMA

1. Testez la séquence d’exons pour la formation éventuelle de structures secondaires lors de la PCR à l’aide de mFold.
   1. Allez sur le serveur Web UNAFold | cliquez sur mFold | dans le menu déroulant, cliquez sur Applications | Forme de pliage de l’ADN.
   2. Entrez le nom de la séquence dans la case et collez l’exon.
   3. Réglez la température de pliage à 60 °C ; dans les conditions ioniques, changez [Mg⁺⁺] à 1,5, et dans les unités, passez à mM ; cliquez sur Plier l’ADN.
   4. Sur la sortie, sous la structure 1, cliquez sur pdf pour ouvrir les tracés de la structure circulaire.
2. Aller à NCBI Blast - Primer Blast pour la conception d’apprêt.
3. Copiez et collez la séquence d’exons sélectionnée déterminée par le séquençage à l’étape 1.1 (la séquence qui contient le plus petit nombre de SNP ou aucun SNP) dans la case en haut de la page.
4. Utilisez le symbole < > pour marquer et exclure les séquences qui contiennent des SNP, le site cible et les régions avec possibilité de formation d’une structure secondaire.
5. Sélectionnez la taille du produit PCR entre 80 et 150 pb et choisissez l’organisme <br /> note: Des fragments de plus grande taille peuvent être utilisés avec succès (~300 pb). Cependant, des amplicons plus longs peuvent diminuer la sensibilité entre des séquences différant dans une ou quelques paires de bases.
6. Cliquez sur Obtenir des amorces. Sélectionnez 2 à 3 paires d’amorces à tester (idéalement, les sites d’amorces sont à ≥20 à 50 pb de tout site cible CRISPR).

3. Validation de l’amorce

1. Effectuez une PCR de gradient à l’aide de l’ADNg d’un seul individu.
   1. Préparez un mixage maître et prélevez un échantillon pour le contrôle sans modèle (NTC) dans un tube séparé. Ajoutez le modèle au mélange maître restant et aliquote dans une plaque à 96 puits.
   2. Respectez les paramètres de cycle : 98 °C 30 s, 34 cycles de 98 °C pendant 10 s, 55–65 °C 30 s, 72 °C 15 s ; extension finale de 72 °C pendant 10 min.
   3. Générer des profils de fusion thermique en suivant les paramètres : étape de dénaturation 95 °C pendant 1 min, recuit 60 °C pendant 1 min, détection de la courbe de fusion entre 75 °C et 95 °C par incréments de 0,2 °C, avec un temps de maintien de 10 s à chaque température.
      note: Seules les températures de recuit avec un seul profil de fusion thermique doivent être utilisées.

Résultats

Figure 1 : Identification des SNP. Représentation schématique de l’alignement de séquences multiples d’un fragment d’AaeZIP11 de type sauvage. En rouge se trouvent les SNP, et en vert les fragments exempts de SNP ; cette région exempte de SNP est suggérée pour la conception de l’ARNsg et des amorces. Abréviations : SNP = polymorphisme nucléotidique unique ; ARNsg = AR...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
70 % d’éthanol			Solution d’éthanol à 70 % dans l’eau
Plaques PCR 96 puits et PCR en temps réel	VWR	Référence 82006-636	Pour l’obtention de l’ADN génomique (à partir de la patte du moustique)
Gabarits de plaques à 96 puits			Imprimé maison, pour l’enregistrement du génotype
Bio Rad CFX96	Bio Rad		Machine PCR avec capacités de gradient et HRMA
Réservoirs de réactifs Biotech diversifiés	VWR	Référence 490006-896
Kit de nettoyage rapide par PCR Exo-CIP	Biolabs de la Nouvelle-Angleterre	E1050S
Boîte de Pétri en verre	VWR	Référence 89001-246	150 mm x 20 mm
Nunc Ruban d’étanchéité en polyoléfine acrylate, Thermo Scientific	VWR	Référence 37000-548	À utiliser avec les plaques PCR à 96 puits pour l’obtention d’ADN génomique
Kit PCR directe pour les tissus animaux Phire (sans outils d’échantillonnage)	Thermo Fisher	F140WH	Pour l’obtention d’ADN génomique et la réalisation de PCR
Logiciel d’analyse de fusion de précision	Bio Rad	1845025	Utilisé pour le génotypage des échantillons d’ADN de moustique et l’analyse des propriétés de dénaturation thermique de l’ADN double brin (voir protocole étape 3.3)
Pipette monocanal	Gilson
Kit PCR directe pour les tissus animaux Phire (sans outils d’échantillonnage)	Thermo Fisher	F140WH	Pour l’obtention d’ADN génomique et la réalisation de PCR
SeqMan Pro	Logiciel DNAstar Lasergene		Pour l’alignement de plusieurs séquences
Pipette monocanal	Gilson