PCR numérique duplex pour la quantification simultanée de marqueurs génétiques doubles

Résumé

Source : Cao, Y., et al. A Essai PCR numérique duplex pour la quantification simultanée de l’Enterococcus spp. et le marqueur HF183 associé aux matières fécales humaines dans les eaux. J. Vis. Exp. (2016)

Dans cette vidéo, nous faisons la démonstration de la technique de PCR numérique duplex (ddPCR), une modification de la technique PCR traditionnelle qui est utile pour détecter simultanément deux marqueurs génétiques différents. Une seule réaction de PCR est divisée en gouttelettes émulsionnées de la taille d’un nanolitre qui sont amplifiées indépendamment, et la détection de signaux d’amplification de fluorescence de couleurs différentes à partir de la fraction de gouttelettes est utilisée pour calculer la concentration initiale des séquences cibles.

Protocole

1. Préparation du mélange de dosage

1. Atteindre des concentrations de matière de 100 μmol/L pour toutes les amorces dans de l’eau de qualité moléculaire et des sondes dans un tampon TE pH 8 [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ ; HF183-1, BthetR1, BthetP].
   REMARQUE : Les sondes pour les deux cibles sont marquées par fluorescence avec des fluorophores différents, comme indiqué dans la liste des matériaux/équipements.
2. Préparez le mélange maître en mélangeant, selon la réaction prévue, 12 μl de mélange PCR numérique (2x stock, voir la liste des matériaux/équipements), 0,216 μl d’amorce avant et inverse, 0,06 μl de sonde fluorescente et 5,016 μl d’eau sans nucléase (concentration finale : 900 nM chaque amorce, 250 nM chaque sonde). Pipeter de haut en bas au moins 10 fois pour mélanger tout en prenant soin de ne pas introduire de bulles d’air dans la solution.
3. Pipeter un mélange maître de 18 μl (à partir de l’étape 1.2) dans un tube ou une plaque PCR ordinaire, en mélangeant une matrice d’ADN de 6 μl (extraite comme décrit précédemment) pour obtenir un mélange de test pour la génération de gouttelettes. Si vous analysez des échantillons en double, pipetez 36 μl de master mix et 12 μl de matrice d’ADN dans chaque puits. Laissez les puits de réplication correspondants vides sur la plaque. Inclure des contrôles positifs (voir la liste des matériaux/équipements) et aucun contrôle de gabarit (c.-à-d. avec de l’eau de qualité moléculaire utilisée comme modèle).
   note: Un contrôle positif est nécessaire pour s’assurer que le test fonctionne correctement et le NTC est nécessaire pour s’assurer qu’il n’y a pas de contamination à l’intérieur de la plaque et pour établir la référence fluorescente plus tard dans l’analyse des données. Il est recommandé aux utilisateurs novices d’utiliser des échantillons d’ADN non dilués et dilués.

2. Génération de gouttelettes et configuration de la plaque PCR

1. Mélangez les mélanges de dosage en pipetant de haut en bas environ 15 fois à l’aide d’une pipette multicanaux. Assurez-vous que la pointe de la pipette reste dans le liquide pour éviter de faire des bulles excessives dans le mélange.
2. Insérez la cartouche 1 (contenant 8 puits) dans un porte-cartouche blanc et cliquez sur le porte-cartouche. La cartouche 1 est maintenant fermement en place et ne peut pas être délogée du support lors de la génération de gouttelettes. À l'aide d'une pipette multicanaux, transférez doucement 20 μl de mélange de dosage dans la position médiane de la cartouche marquée « Échantillon » sans introduire de bulles d'air.
3. Pipette dans 70 μl d'huile de génération de gouttelettes sur le côté gauche de la cartouche (marquée « Huile »).
4. Couvrez la cartouche avec un joint en vous assurant que le joint est plat et maintenu uniformément par les 4 tics vers le bord de la cartouche. Appuyez sur le bouton vert du générateur de gouttelettes pour ouvrir et placer la cartouche. Appuyez à nouveau sur le bouton vert pour fermer le générateur.
   note: Une fois la porte fermée, le bouton est atténué, la porte ne peut pas être rouverte et la génération de gouttelettes commence immédiatement et continue pendant environ 1 min.
5. Si vous effectuez plus de 8 réactions, placez la cartouche 2 dans un deuxième porte-cartouche blanc et préparez-la de la même manière que la cartouche 1 pendant la génération des gouttelettes pendant la génération des gouttelettes pour économiser le temps total de configuration.
6. Ouvrez la porte du générateur de gouttelettes lorsque le bouton faiblement éclairé devient vert, indiquant la fin de la génération de gouttelettes. Retirez le porte-cartouche blanc contenant la cartouche 1, mettez-le de côté et placez la cartouche 2 sur le générateur de gouttelettes.
7. Retirez le joint de la cartouche 1 et jetez-le. Transférez doucement le volume total (environ 40 μl) des gouttelettes générées à partir de la troisième colonne de la cartouche (marquées « Gouttelettes ») sur une plaque PCR finale (maintenue à température ambiante) pour le cycle thermique.
   note: Ne décliquez pas le porte-cartouche blanc car l’action pourrait casser les gouttelettes nouvellement générées ; N’ouvrez le porte-cartouche qu’une fois que les gouttelettes ont été transférées sur la plaque finale.
8. Répétez les étapes 2.1 à 2.7 pour d’autres échantillons.
9. Lorsque toutes les gouttelettes se trouvent dans la plaque PCR finale, placez un couvercle en aluminium perçable sur le dessus de la plaque et placez-le sur une scelleuse de plaques. Réglez la soudeuse à 180 °C, appuyez sur « Play » sur la soudeuse et laissez sceller pendant 10 secondes.

3. Cycle thermique et lecture des gouttelettes

1. Placez la plaque scellée sur le thermocycleur, compatible avec la plaque PCR finale utilisée à l’étape 2.7, et une vitesse de montée en température de 2,0 °C/s.
2. Exécutez le programme thermique comme suit : 10 min à 95 °C, suivi de 40 cycles de 30 secondes à 94 °C et 60 secondes à 60 °C, suivis d’un maintien de 10 minutes à 98 °C (facultatif : maintien final à 4 ou 15 °C).
3. Une fois le cycle terminé, transférez la plaque dans un lecteur de gouttelettes pour une mesure automatique de la fluorescence dans chaque gouttelette de chaque puits. Vous pouvez également conserver la plaque à 4 °C jusqu’à 3 jours avant la lecture des gouttelettes. Assurez-vous que les gouttelettes sont à température ambiante avant de procéder à la lecture.
   1. Ouvrez le logiciel d’accompagnement pour configurer la lecture des gouttelettes. Dans le menu « Configuration » par défaut contenant un schéma d'une plaque vide de 96 puits, double-cliquez sur le puits A1 pour ouvrir le menu contenant trois sections : « Échantillon », « Essai 1 » et « Essai 2 ».
   2. Dans la section « Échantillon », tapez l'ID de l'échantillon dans la case intitulée « Nom » et appuyez sur Entrée ou cochez la case à droite marquée « Appliquer ». Ensuite, cliquez sur le menu déroulant intitulé « Expérience » et choisissez « ROUGE » (détection d'événements rares), puis cliquez sur Entrée.
   3. Passez à la section « Essai 1 ». Dans la section « Nom », remplissez le test (p. ex., Enterococcus) et cliquez sur Entrée. Dans la case ci-dessous intitulée « Type », cliquez sur le menu déroulant et choisissez « Canal 1 inconnu », puis cliquez sur Entrée.
   4. Passez à la section « Essai 2 ». Dans la section « Nom », remplissez le test (p. ex. HF183) et cliquez sur Entrée. Dans la case ci-dessous intitulée « Type », cliquez sur le menu déroulant et choisissez « Canal 2 inconnu », puis cliquez sur Entrée. Toutes les informations des étapes 3.3.2 à 3.3.4 sont maintenant présentes dans le puits A1.
   5. Nommez tous les puits subséquents contenant des gouttelettes. Pour économiser le temps total de configuration, cliquez sur « Maj » ou « Ctrl » pour choisir plusieurs puits simultanément.
   6. Lorsque la représentation numérique de la plaque reflète la plaque physique, appuyez sur « OK » en bas à droite du menu. Dans le nouveau menu qui apparaît en haut du schéma de plaque, sous la section 'Modèle', choisissez 'Enregistrer sous' et nommez et enregistrez la plaque.
   7. À gauche de l'écran, cliquez sur « Exécuter » et sélectionnez le jeu de teintures approprié dans la fenêtre contextuelle « Options d'exécution ». La collecte des données est lancée et affichée en temps réel dans le logiciel.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Microtubes à faible liaison	Costar	Référence 3207	Pour le stockage de réactifs, d’échantillons/production de mélanges maîtres
Eau sans nucléases	FisherSci	Réf. BP2484-50
Tampon TE pH 8	FisherSci	Réf. BP2473-100
Plaque rigide à 96 puits	BioRad	HSP-9601	Pour le mélange maître initial et l’inoculation de l’échantillon
Film d’étanchéité en aluminium	BioRad	Référence 359-0133	Pour sceller la plaque d’échantillon
Générateur de gouttelettes	BioRad	186-3002
Huile de génération de gouttelettes	BioRad	186-3005
cartouche	BioRad	Référence 186-4008
Porte-cartouche DG8	BioRad	Référence 186-3051
joint	BioRad	Référence 186-3009
Pointes de pipette de 20 μL	Rainin	GP-L10F	Pour le tansferrage d’échantillons/mastermix à cartidge
Pointes de pipette de 200 μL	Rainin	GP-L200F	Pour le transfert des gouttelettes vers la plaque Twin.Tec finale
Plaque Twin.Tec à 96 puits	Eppendorf	951020320	Pour le cycle thermique et la lecture des gouttelettes finales
Feuille de thermoscellage perçable	BioRad	Référence 181-4040	Pour sceller la plaque Twin.Tec avant le cycle thermique
Scelleuse de plaques PX1 PCR	BioRad	Référence 181-4000	Seul le thermocycleur est nécessaire, pas d’optique
CFX96 Thermocycleur	BioRad	CFX96 et C1000
Lecteur de gouttelettes QX100	BioRad	Référence 186-3001
Huile pour lecteur de gouttelettes	BioRad	Référence 186-3004
PCR par gouttelettes Supermix	BioRad	Référence 186-3024	c’est-à-dire le mélange PCR numérique dans le manuscrit
Logiciel QuantaSoft (v1.3.2)	Quantasoft	Le QX100	Pour l’affichage, l’analyse et l’exportation de données ddPCR
Amorce Entero Forward (Ent F1A)	opéron	GAGAAATTCCAAACGAACTTG	Un autre fournisseur peut être utilisé
Amorce inverse Entero (Ent R1)	opéron	CAGTGCTCTACCTCCATCATT	Un autre fournisseur peut être utilisé
Sonde entérologique (GPL813TQ)	opéron	[6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1]	Un autre fournisseur peut être utilisé, mais le fluorophore doit être FAM
HF183 Apprêt avant (HF183-1)	opéron	ATCATGAGTTCACATGTCCG	Un autre fournisseur peut être utilisé
HF183 Amorce inversée (BthetR1)	opéron	CGTAGGAGTTTGGACCGTGT	Un autre fournisseur peut être utilisé
Sonde HF183 (BthetP1)	opéron	[6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1]	Un autre fournisseur peut être utilisé, mais le fluorophore doit être HEX (si vous utilisez VIC, la compensation matricielle appropriée doit être choisie).
Contrôle positif			Mélange d’ADN génomique d’E. faecalis et de plasmide standard HF183 (commandé auprès d’IDT). Pour des méthodes détaillées de culture d’E. faecalis et des séquences du plasmide HF183 ordonné, veuillez consulter Cao et al. 2015 (doi :10.1016/j.watres.2014.12.008). Les étalons d’ADN d’Enterococcus disponibles dans le commerce (ATCC 29212Q-FZ) peuvent également être utilisés dans le contrôle positif à la place de l’ADN génomique d’E. faecalis préparé en laboratoire.