PCR numérique duplex pour la quantification simultanée de marqueurs génétiques doubles

Résumé

Source : Cao, Y., et al. A Essai PCR numérique duplex pour la quantification simultanée de l’Enterococcus spp. et le marqueur HF183 associé aux matières fécales humaines dans les eaux. J. Vis. Exp. (2016)

Dans cette vidéo, nous faisons la démonstration de la technique de PCR numérique duplex (ddPCR), une modification de la technique PCR traditionnelle qui est utile pour détecter simultanément deux marqueurs génétiques différents. Une seule réaction de PCR est divisée en gouttelettes émulsionnées de la taille d’un nanolitre qui sont amplifiées indépendamment, et la détection de signaux d’amplification de fluorescence de couleurs différentes à partir de la fraction de gouttelettes est utilisée pour calculer la concentration initiale des séquences cibles.

Protocole

1. Préparation du mélange de dosage

1. Atteindre des concentrations de matière de 100 μmol/L pour toutes les amorces dans de l’eau de qualité moléculaire et des sondes dans un tampon TE pH 8 [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ ; HF183-1, BthetR1, BthetP].
   REMARQUE : Les sondes pour les deux cibles sont marquées par fluorescence avec des fluorophores différents, comme indiqué dans la liste des matériaux/équipements.
2. Préparez le mélange maître en mélangeant, selon la réaction prévue, 12 μl de mélange PCR numérique (2x stock, voir la liste des matériaux/équipements), 0,216 μl d’amorce avant et inve....

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Microtubes à faible liaison	Costar	Référence 3207	Pour le stockage de réactifs, d’échantillons/production de mélanges maîtres
Eau sans nucléases	FisherSci	Réf. BP2484-50
Tampon TE pH 8	FisherSci	Réf. BP2473-100
Plaque rigide à 96 puits	BioRad	HSP-9601	Pour le mélange maître initial et l’inoculation de l’échantillon
Film d’étanchéité en aluminium	BioRad	Référence 359-0133	Pour sceller la plaque d’échantillon
Générateur de gouttelettes	BioRad	186-3002
Huile de génération de gouttelettes	BioRad	186-3005
cartouche	BioRad	Référence 186-4008
Porte-cartouche DG8	BioRad	Référence 186-3051
joint	BioRad	Référence 186-3009
Pointes de pipette de 20 μL	Rainin	GP-L10F	Pour le tansferrage d’échantillons/mastermix à cartidge
Pointes de pipette de 200 μL	Rainin	GP-L200F	Pour le transfert des gouttelettes vers la plaque Twin.Tec finale
Plaque Twin.Tec à 96 puits	Eppendorf	951020320	Pour le cycle thermique et la lecture des gouttelettes finales
Feuille de thermoscellage perçable	BioRad	Référence 181-4040	Pour sceller la plaque Twin.Tec avant le cycle thermique
Scelleuse de plaques PX1 PCR	BioRad	Référence 181-4000	Seul le thermocycleur est nécessaire, pas d’optique
CFX96 Thermocycleur	BioRad	CFX96 et C1000
Lecteur de gouttelettes QX100	BioRad	Référence 186-3001
Huile pour lecteur de gouttelettes	BioRad	Référence 186-3004
PCR par gouttelettes Supermix	BioRad	Référence 186-3024	c’est-à-dire le mélange PCR numérique dans le manuscrit
Logiciel QuantaSoft (v1.3.2)	Quantasoft	Le QX100	Pour l’affichage, l’analyse et l’exportation de données ddPCR
Amorce Entero Forward (Ent F1A)	opéron	GAGAAATTCCAAACGAACTTG	Un autre fournisseur peut être utilisé
Amorce inverse Entero (Ent R1)	opéron	CAGTGCTCTACCTCCATCATT	Un autre fournisseur peut être utilisé
Sonde entérologique (GPL813TQ)	opéron	[6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1]	Un autre fournisseur peut être utilisé, mais le fluorophore doit être FAM
HF183 Apprêt avant (HF183-1)	opéron	ATCATGAGTTCACATGTCCG	Un autre fournisseur peut être utilisé
HF183 Amorce inversée (BthetR1)	opéron	CGTAGGAGTTTGGACCGTGT	Un autre fournisseur peut être utilisé
Sonde HF183 (BthetP1)	opéron	[6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1]	Un autre fournisseur peut être utilisé, mais le fluorophore doit être HEX (si vous utilisez VIC, la compensation matricielle appropriée doit être choisie).
Contrôle positif			Mélange d’ADN génomique d’E. faecalis et de plasmide standard HF183 (commandé auprès d’IDT). Pour des méthodes détaillées de culture d’E. faecalis et des séquences du plasmide HF183 ordonné, veuillez consulter Cao et al. 2015 (doi :10.1016/j.watres.2014.12.008). Les étalons d’ADN d’Enterococcus disponibles dans le commerce (ATCC 29212Q-FZ) peuvent également être utilisés dans le contrôle positif à la place de l’ADN génomique d’E. faecalis préparé en laboratoire.