1. Quantification de l’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre à micro-volume
- Assurez-vous que les paramètres du spectrophotomètre sont réglés sur ARN.
- Utilisez 1 à 2 μL d’eau de qualité moléculaire pour initialiser la machine et définir une ligne de base.
- Utilisez 1 à 2 μL de chaque échantillon d’ARN d’essai pour évaluer la quantité d’ARN.
- Enregistrez les relevés et documentez.
- Ajustez l’ARN à 1 μg/μL, si nécessaire.
note: L’ARN doit être conservé sur de la glace (ou dans un bloc frais) en tout temps. Si l’ARN est obtenu à l’aide d’une méthode sur colonne ou sur billes, l’ARN est généralement inférieur à 1 μg/μL. Dans cette situation, utilisez l’ARN pur.
2. Préparation de séries de dilution d’ARN pour déterminer la sensibilité au point final
- Faites une dilution en série de 10 fois de l’ARN.
- Étiquetez les tubes avec la série de dilution (par exemple, 10-1, 10-2, etc.) et les détails de l’ARN.
- Ajoutez 45 μL d’eau de qualité moléculaire dans chaque tube.
- Ajouter 5 μL d’ARN (préalablement dilué à 1 μg/μL) et bien mélanger.
- Jetez l’embout de la pipette dans le désinfectant approprié et remplacez-le par un nouvel embout.
- Prélever 5 μL du 10-1 et l’ajouter au tube 10-2 et bien mélanger.
- Répéter les étapes 2.1.3 à 2.1.5 avec les dilutions restantes.
REMARQUE : L’ARN doit être conservé sur de la glace (ou dans un bloc froid) en tout temps.
3. Préparation des réactions RT-PCR en temps réel
- À l’aide d’une feuille de calcul, planifiez la disposition des plaques en fonction du nombre d’échantillons d’essai et d’échantillons de contrôle, pour les dosages du lyssavirus et de l’actine ß.
note: Si 4 échantillons doivent être testés en double avec un contrôle positif et négatif, cela équivaut à 10 réactions pour les deux tests.
- Dans une « salle blanche » ou une zone séparée de la matrice d'ARN, essuyez les surfaces avec un désinfectant approprié avant utilisation ou préparez un poste de travail PCR (le cas échéant). Pour préparer le poste de travail, essuyez la surface de l’armoire avec un désinfectant approprié, placez les articles nécessaires dans le poste de travail et fermez les portes. Allumez la lumière UV pendant 10 minutes.
- Retirer les réactifs et les amorces du congélateur et les décongeler (réactifs énumérés dans le tableau 1 et amorces dans le tableau 2).
REMARQUE : Le mélange d’enzymes est stocké dans du glycérol et ne nécessite donc pas de décongélation et doit être conservé sur de la glace (ou dans un bloc frais) en tout temps. Tous les autres réactifs peuvent être décongelés à température ambiante.
- Une fois décongelé, mélangez brièvement les réactifs et centrifugez-les pour recueillir le liquide.
REMARQUE : Ne vortex pas le mélange d’enzymes, il suffit de centrifuger brièvement.
- Préparez des mélanges maîtres séparés pour le lyssavirus et la ß-actine. Pour chaque réaction, ajoutez 7,55 μL d’eau de qualité moléculaire, 10 μL de mélange réactionnel vert 2x Universal SYBR, 0,6 μL d’amorce directe, 0,6 μL d’amorce inverse, 0,25 μL de mélange d’enzymes iTaq RT.
- Utilisez une feuille de calcul pour calculer les volumes corrects afin d’éviter les erreurs de calcul manuel. Assurez-vous qu’un master-mix suffisant est préparé pour compenser les erreurs de pipetage. Par conséquent, si 10 réactions sont nécessaires (voir NOTE en 3.1), préparez 12 réactions
- Préparez le master-mix sur de la glace (ou dans un bloc froid) et restez sur de la glace jusqu’à ce qu’il soit placé dans la machine en temps réel.
- Mélangez les mélanges maîtres préparés, centrifugez brièvement et versez 19 μL dans les puits appropriés de tubes à bande ou une plaque à 96 puits compatible avec la machine en temps réel utilisée.
REMARQUE : Minimisez la production de bulles dans les puits pendant le pipetage.
- Dans une pièce séparée ou dans une armoire UV préparée comme décrit en 3.2, ajoutez soigneusement 1 μL de l’ARN préalablement ajusté à 1 μg/μL (voir l’étape 1.5) sous la surface du puits de mélange principal approprié et mélangez doucement. Jetez la pointe de la pipette dans le désinfectant directement après utilisation (sous la surface).
- Ajoutez les témoins après les échantillons d’essai, avec le témoin positif ajouté ensuite et le contrôle sans matrice (NTC – eau de qualité moléculaire) ajouté en dernier. La quantité d’ARN utilisée peut être modifiée en fonction du type d’échantillon et de l’extraction d’ARN utilisée. La quantité utilisée doit être validée pour s’assurer que la réaction est optimisée.
- Scellez la plaque à l’aide de couvercles en bande ou d’une scelleuse en prenant soin de vous assurer que tous les couvercles sont bien fermés et étiquetés suffisamment pour orienter les échantillons. Étiquetez le bord de la plaque/des tubes de bande.
- Faites tourner les échantillons à l’aide d’une centrifugeuse pour recueillir tout le liquide au fond des puits.
- Transférez la plaque sur la machine de PCR en temps réel, ouvrez la porte et placez-la dans le support en veillant à l’emplacement/orientation corrects des échantillons conformément à la disposition de la plaque.
REMARQUE : Si des bandes de tubes sont utilisées, assurez-vous que le support est en place.
- Ouvrez le programme de la machine PCR en temps réel et choisissez l’option pour l’expérience en temps réel SYBR avec courbe de dissociation. Programmez l’appareil de PCR en temps réel en utilisant les conditions de cyclage thermique spécifiées dans le tableau 3, y compris les points de collecte de données.
- Sélectionnez SYBR comme colorant fluorescent et sélectionnez inconnu comme type d’échantillon, puis insérez un nom dans la case du nom de l’échantillon correct.
note: Faites la différence entre les réplicats et aussi entre le lyssavirus et les puits de ß-actine.
- Choisissez un emplacement de fichier pour enregistrer les données expérimentales, assurez-vous que la lampe sera éteinte à la fin de l’exécution, puis démarrez la course.
REMARQUE : Comme la première étape est un étage RT, aucune donnée n’est collectée pendant cette période, par conséquent, si la lampe nécessite une période de préchauffage, cela peut se produire pendant l’étape RT. La machine et le logiciel en temps réel afficheront les courbes d’amplification en temps réel, tandis que la courbe de fusion sera générée à la fin du cycle.
