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1. Extraction d’ADN à partir de tissus FFPE, de sang périphérique et d’aspiration de moelle osseuse
- Pour les tissus FFPE de moelle osseuse avec kit d’extraction d’ADN FFPE
- Commencer avec du tissu FFPE à partir de lames non colorées (5 à 10 sections à 5 à 10 μm d’épaisseur).
note: Si vous commencez par des copeaux de tissu, utilisez 3 à 6 sections de 5 à 10 μm d’épaisseur et passez à l’étape 1.1.6.
- Placez les lames dans un panier à lames et préparez quatre réservoirs de lavage (deux pour le xylène et deux pour l’alcool à 100 %). Ajouter un volume minimum de 600 mL de la solution dans chaque panier.
- Déparaffinisez les lames en effectuant un lavage au xylène de 5 minutes dans le premier plateau. Transférez les lames dans le deuxième réservoir de lavage au xylène pendant 5 minutes supplémentaires.
- Après la déparaffinisation, lavez les lames avec de l’alcool à 100 % pendant 5 min. Transférez les lames dans le deuxième réservoir de lavage à l’alcool pendant 5 minutes supplémentaires.
- Laissez les lames sécher complètement sous un capot avant de les gratter avec une lame de rasoir dans un tube de microcentrifugation.
note: Si une lame H&E avec la région tumorale indiquée est disponible, alignez les lames et grattez uniquement la région tumorale.
- Suivez les instructions du document du fabricant inclus dans le kit.
- Pour l’aspiration de BM et le sang périphérique
- Extrayez selon les instructions du fabricant, document avec ces spécifications.
note: Il existe de nombreux kits et méthodes disponibles dans le commerce pour l’extraction de l’ADN à partir de tissus et de cellules FFPE. En pratique, tous peuvent être utilisés. Utiliser une méthode établie en laboratoire.
- Utilisez 200 μL de sang périphérique (PB) ou 100 μL de BM + 100 μL de PBS.
- Utilisez 4 μL de solution mère de RNase A.
- Elutation avec tampon d’élution de 100 μL.
- Quantification de l’ADN
- Mesurer les concentrations d’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre assurant un rapport 260 nm/280 nm d’environ 1,8 (pour l’ADN pur). Si le rapport est sensiblement inférieur, cela peut indiquer la présence de protéines, de phénols ou d’autres contaminants qui peuvent interférer avec les applications en aval.
- Ajustez les concentrations d’ADN à environ 50 - 100 ng/μL avec un tampon d’élution approprié.
2. PCR bloquante de type sauvage
- Conception d’apprêt
- Concevoir et obtenir des amorces pour les gènes d’intérêt conformément aux directives générales de conception d’amorces PCR décrites précédemment. Inclure des amorces de séquençage universelles M13-forward et reverse dans les amorces PCR.
note: Le test MYD88 a été développé pour amplifier l'exon 5 de MYD88 (G259 - N291) et 110 nucléotides situés dans la région intronique 5' pour couvrir le site d'épissage et une partie de l'intron 4. Les amorces avant et arrière ont été conçues avec une séquence 5'-M13 (M13- avant : tgt aaa acg acg gcc agt ; M13-reverse : cag gaa aca gct atg acc) pour permettre le recuit des amorces de séquençage complémentaires (voir tableau des matériaux).
- Conception d’oligonucléotides d’acide nucléique verrouillé
- Concevoir l’oligonucléotide bloquant de manière à ce qu’il ait une longueur d’environ 10 à 15 bases et qu’il soit complémentaire à la matrice WT où l’enrichissement en mutant est souhaité.
note: Un oligo plus court améliorera la discrimination des inadéquations. Pour obtenir une spécificité de cible élevée, il est important de ne pas utiliser trop de nucléotides bloquants, car cela peut entraîner un oligonucléotide très « collant ». Le contenu, la longueur et le nucléotide bloquant doivent être optimisés en fonction du nucléotide spécifique à bloquer. Il est important d’obtenir une spécificité de liaison élevée sans compromettre la structure secondaire et risquer l’auto-complémentarité.
- Concevez l’oligo-isolant de blocage de manière à ce qu’il se situe à 10 - 15 °C au-dessus de la température d’extension pendant le thermocyclage. Ajustez le Tm en ajoutant ou en supprimant des bases bloquantes ou en substituant des bases bloquantes à l’ADN tout en évitant les longs tronçons (3 à 4 bases) de bases G ou C bloquantes.
- Naviguez sur le site Web des outils Oligo (voir Tableau des matériaux) et sélectionnez l’outil « blocage de la prédiction Oligo Tm ».
- Collez la séquence du modèle WT que l’on souhaite bloquer dans la case « Séquence Oligo ». Ajoutez un « + » devant les bases pour indiquer les bases des bloqueurs.
- Sélectionnez le bouton « Calculer » pour déterminer le Tm approximatif de l’hybride bloqueur d’ADN.
- Concevez l’oligo bloquant de manière à éviter la formation d’une structure secondaire ou d’autodimères.
- Naviguez sur le site Web des outils Oligo (voir Tableau des matériaux) et sélectionnez l’outil « bloquant Oligo Optimizer ».
- Collez la séquence du modèle WT que vous souhaitez bloquer dans la boîte. Ajoutez un « + » devant les bases pour indiquer les bases bloquantes.
- Cochez les deux cases « Structure secondaire » et « Autonome seulement ». Appuyez sur le bouton Analyser pour examiner l’oligo à la recherche de structures secondaires potentiellement gênantes ou d’autodimères.
note: Les scores représentent des estimations très approximatives des Tm des structures secondaires et des auto-dimères. Des scores plus bas sont donc optimaux et peuvent être obtenus en limitant l’appariement bloqueur-bloqueur. L'oligonucléotide bloquant pour MYD88 [bloqueur de MYD88 (TCAGA+AG+C+G+A+C+T+A+T+CC/invdT/)] a été conçu pour couvrir les acides aminés Q262-I266 et présente un dT inversé 3' pour inhiber à la fois les extensions par l'ADN polymérase et la dégradation par l'exonucléase 3'. Cet oligo bloquant spécifique est un 17 mer avec 10 bases bloquantes qui sont notées « +N ». Les 7 bases restantes sont des nucléotides d’ADN ordinaires.
- Configuration WTB-PCR et thermocyclage
- Préparez un master mix WTB-PCR (MMX) à l’aide d’un tampon de réaction PCR de 2,5 μL 10x avec 20 mM de MgCl2, de dNTP de 250 μM, d’une amorce directe et inverse de 0,2 μM, d’un bloqueur de MYD88 de 1,2 μM et de la DNAse, sans RNAse, ultra-pure H2O pour créer un volume de solution finale de 21,75 μL par réaction.
note: Les concentrations de travail correspondent au volume final de la réaction de 25 μL (après l’ajout de la matrice d’ADN et de la polymérase). La PCR MMX conventionnelle est préparée en omettant simplement l’ajout d’un bloqueur. Toutes les étapes du protocole restent identiques pour la WTB et la PCR conventionnelle. Cela peut être utilisé pour valider et déterminer l’enrichissement obtenu par l’ajout d’un bloqueur.
- Lorsque vous calculez la quantité de MMX à préparer, assurez-vous de tenir compte de 3 réactions supplémentaires (témoins positifs et négatifs et un contrôle non matriciel pour vérifier la contamination) et d’au moins 1 réaction supplémentaire en cas d’erreur de pipetage.
- Vortex MMX à fond. Le MMX peut être stocké à -80 °C jusqu’à un an.
- Ajouter 0,25 μL d’ADN polymérase Taq par réaction au MMX et retourner pour mélanger. Une fois que la polymérase a été ajoutée au MMX, gardez-le sur de la glace.
- Placez une nouvelle plaque de PCR à 96 puits sur une plaque froide et pipetez 22 μL de MMX avec la polymérase à chaque puits de réaction.
- Ajouter 3 μL d’ADN génomique (50 à 100 ng/μL) dans chacun des puits contenant le MMX avec la polymérase.
- Fermez brièvement la plaque et centrifugez pour vous assurer que la solution atteint le fond de chaque puits.
- Chargez la plaque PCR sur un thermocycleur.
- Réglez les conditions de thermocyclage de la réaction WTB-PCR comme suit : dénaturation initiale à 95 °C pendant 6 min ; 40 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 30 s, recuit d’amorce à 56 °C pendant 30 s et extension à 72 °C pendant 1 min 20 s ; extension finale à 72 °C pendant 10 min
note: La meilleure pratique consiste à effectuer le reste du protocole dans une zone physiquement séparée afin d’éviter la contamination par les amplicons lors des futures configurations.