Réaction en chaîne de la polymérase quantitative pour dénombrer les bactériophages

Résumé

Source : Peng, X., et al., PCR quantitative du bactériophage T7 à partir de Biopanning. J. Vis. Exp. (2018)

Dans cette vidéo, nous discutons de la réaction en chaîne quantitative par polymérase, qPCR, pour dénombrer les bactériophages T7 par quantification de l’ADN. Le colorant fluorescent dans le mélange PCR se lie aux brins d’ADN nouvellement synthétisés et émet une fluorescence, qui est mesurée.

Protocole

1. Préparer les réactions qPCR

REMARQUE : Une réaction PCR concerne un échantillon. Chaque réaction PCR contient 5 μL de mélange maître qPCR (voir matériaux), 1 μL de mélange de paires d’amorces 5 μM, 2 μL de H₂O et 2 μL d’échantillon de phage T7 traité thermiquement. Pour les réactions PCR multiples, tous les réactifs, à l’exception de l’échantillon de phage, sont prémélangés dans un tube de 1,5 ml. Le volume de chaque réactif dans le prémélange dépend du nombre d’échantillons de phages pour la qPCR.

1. Préparez le prémélange qPCR pour 10 échantillons de phages biopanés de concentration inconnue et 7 échantillons de concentrations standard en trois exemplaires. Par conséquent, il y a 51 échantillons au total et, par conséquent, 51 réactions qPCR (c’est-à-dire une réaction par échantillon). Pour 51 réactions, préparez un prémélange de 255 μL de mélange maître qPCR (51 x 5 μL), 51 μL d’amorces (51 x 1 μL) et 102 μL de H₂O (51 x 2 μL).
   note: Il est recommandé de préparer quelques réactions PCR supplémentaires pour compenser la perte de volume lors de l’aliquotage du mélange PCR dans chaque puits de la plaque qPCR à 96 puits.
2. Aliquote 8 μL de prémélange PCR dans chaque puits d’une plaque qPCR à 96 puits pour un total de 51 puits (c.-à-d. 51 réactions qPCR). Il n’est pas nécessaire de changer les pointes lors de l’aliquotage.
3. Ajouter 2 μL d’échantillons de phages T7 traités thermiquement ou d’ADN de référence de phage T7 dans chaque puits (figure 1B) ; changer les pointes lorsque vous ajoutez différents échantillons d’ADN dans le puits pour éviter la contamination croisée. De plus, distribuez les échantillons d’ADN de 2 μL sous la surface du prémélange qPCR (c’est-à-dire dans le prémélange PCR de 8 μL).
4. Scellez la plaque qPCR avec un film adhésif.
   note: Cette étape est critique, quel que soit le type de plaque qPCR. Utilisez le kit recommandé pour sceller complètement la plaque ; sinon, toute région non scellée de la plaque entraînera une perte de volume pendant le cycle PCR.
5. Enveloppez la plaque qPCR avec une feuille d’aluminium pour minimiser le photoblanchiment par fluorescence et procédez à son exécution sur l’équipement qPCR.

2. Conditions de cyclisme qPCR

REMARQUE : des conditions de cycle qPCR ont été définies sur l’équipement qPCR spécifique.

1. Exécutez la plaque qPCR à 96 puits sur l’équipement qPCR. Sur l’équipement, sélectionnez les paramètres dans le menu pour configurer les conditions expérimentales suivantes (Figure 1C).
2. Pour un volume d’échantillon de 10 μL, définissez les conditions de cycle suivantes : un cycle à 50 °C pendant 2 min, un cycle à 95 °C pendant 2 min, suivi de 40 cycles (95 °C pendant 15 s, 60 °C pendant 1 min). Ensuite, exécutez les réglages de la courbe de fusion : un cycle de 95 °C pendant 15 s, 60 °C pendant 1 min et 95 °C 15 s.
3. Procédez à l’analyse des données.

Résultats

Figure 1 : Traitement d’échantillons de phages, préparation de la réaction qPCR et exécution de la qPCR. Des échantillons de phages T7 prétraités par la DNase I ont été chauffés à 100°C pendant 15 min pour libérer l’ADN T7 des particules de phages intactes (A) ; le mélange qPCR a été préparé comme décrit dans le protocole. Tous les préparatifs ont été faits sur glace (...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Amorces pour l’ADN génomique T7	IDT		F : CCTCTTGGGAGGAAGAGATTTG R : TACGGGTCTCGTAGGACTTAAT
T7 Sélectionner l’ADN de contrôle de l’emballage	EMD Millipore	Référence 69679-1UG
Plaque de réaction optique MicroAmp à 96 puits	ThermoFisher Scientific	N8010560
qPCR master mix-Power up SYBR Green master mix	Biosystèmes appliqués	Biosystèmes appliqués
Kit de film adhésif optique MicroAmp	ThermoFisher Scientific	ThermoFisher Scientific
UltraPure DNase/RNase-Free distillé H2O	Invitrogen	10977015
Système de PCR en temps réel ViiA7 avec bloc rapide de 96 puits	ThermoFisher Scientific	4453535
Logiciel de PCR en temps réel QuantStudio	ThermoFisher Scientific		v1.2