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1. PCR asymétrique pour l’amplification de l’ADNsb
- Préparez un mélange de réactifs PCR asymétriques pour amplifier l’ADNsb à analyser. Décongeler les réactifs du tableau 1 sur de la glace. Ne conservez pas l’enzyme polymérase Taq (50 U/μL) sur de la glace, mais conservez-la plutôt à 20 °C jusqu’à ce que vous en ayez besoin.
- Agitez doucement tous les réactifs, puis centrifugez brièvement les tubes à 10 000 x g pendant 10 s.
- Combinez tous les réactifs comme décrit dans le tableau 1.
- Placez les échantillons dans un thermocycleur et démarrez la PCR asymétrique dans les conditions suivantes : 25 cycles (95 °C pendant 30 s, 52 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 30 s), 85 °C pendant 5 min, maintenir à 4 °C.
2. Microsphère-PCR pour l’amplification de l’ADNsb
REMARQUE : Cette section décrit le protocole d’amplification de l’ADNsb dans un tube de réaction PCR. Des réactions de microsphère-PCR ont été réalisées dans un volume de réaction de 50 μL. Les séquences détaillées utilisées pour amplifier l’ADNsb sont énumérées dans le tableau 2. Dans ce cas, Ap à la surface des microsphères peut se recuire à des matrices d’ADN aléatoires de manière complémentaire. Il s’agit d’une étape très importante pour la production de brins d’ADN complémentaires (brin d’ADN antisens, Figure 1). L’ADN étendu est utilisé comme matrice pour l’amplification par PCR des microsphères.
- Préparez le mélange de réactifs microsphère-PCR. Décongeler les réactifs du tableau 3 sur de la glace ; cependant, ne gardez pas l’enzyme polymérase Taq sur la glace. Conservez-le à -20 °C jusqu’à ce que vous en ayez besoin.
- Agitez doucement tous les réactifs, puis centrifugez brièvement les tubes à 10 000 x g pendant 10 s.
- Obtenez environ ~25 microsphères par comptage microscopique.
note: Le nombre de microsphères dans un tube réactionnel est calculé à l’aide d’un microscope optique avec un grossissement de 40X. Environ ~25 microsphères sont utilisées pour l’amplification par PCR des microsphères. Des informations plus détaillées se trouvent à l’étape 3.
- Combinez tous les réactifs comme décrit dans le tableau 3.
- Placez les échantillons dans un thermocycleur et démarrez la PCR asymétrique dans les conditions suivantes : 25 cycles (95 °C pendant 30 s, 52 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 30 s), 85 °C pendant 5 min, maintenir à 4 °C.
- Après l’amplification, ajouter 8 μL de tampon de charge 6x et charger 15 μL de chaque échantillon dans un gel d’agarose à 2 %. Ensuite, effectuez une électrophorèse à 100 V pendant 35 min dans 1x tampon TAE (Tris-acétate-EDTA, 40 mM Tris-acétate, 1 mM EDTA, pH 8,2).
Table 1. Composants de mélange de réactifs PCR asymétriques dans une réaction de 20 μL.
| Réactif | Volume pour 1x réaction (μL) | Concentration finale |
| Modèle d’ADN aléatoire | 1 | 1 ng/μL |
| Apprêt à balise directe | 1 | 0,4 μM |
| Amorce inversée | 1 | 0,02 μM |
| 10X tampon Taq | 5 | 1 fois |
| 10 mM de dNTP | 4 | 2,5 millions d’euros |
| Ex taq (1000U) | 0,2 | 1 U |
| Eau | 37,8 | - |
| total | 50 | - |
Tableau 2. Informations de séquence pour Microsphere-PCR.
| modèle | séquence | Longueur (nt) |
| Modèle d’ADN aléatoire | 5'- ATA CCA GCT TAT TCA ATT (Séquence aléatoire, 40 mer) AGA TAG TAA GTG CAA TCT-3' | 76 |
| Apprêt Tag-Forward (Tag-F) | 5'- GGT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG ATA CCA GCT TAT TCA ATT-3' | 42 |
| Amorce inversée | 5'- AGA TTG CAC TTA CTA TCT-3' | 18 |
Table 3. Composants du mélange de réactifs Microsphère-PCR dans une réaction de 50 μL
| Réactif | Volume pour 1x réaction (μL) | Concentration finale |
| Microsphères Ap | ~25 microsphères | - |
| Modèle d’ADN aléatoire | 1 | 1 ng/μL |
| Apprêt Tag-Forward | 1 | 0,4 μM |
| 10X tampon Taq | 5 | 1 fois |
| 10 mM dNTP | 4 | 2,5 millions d’euros |
| Ex taq (1000U) | 0,2 | 1 U |
| Eau | 37,8 | - |
| total | 50 | - |
