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$$\longrightharp{xx}$$,
1. Transcription inverse de l’ARN viral
- Retirez les réactifs RT énumérés dans le tableau 1 du congélateur, conservez-les sur de la glace, puis décongelez-les et vortex-les avant de les utiliser.
- Préparez 12 μL de mélange réactionnel RT dans un tube PCR de 0,2 mL avec les réactifs énumérés dans le tableau 1. Permettre des variations de pipetage en préparant un volume du mélange maître d’au moins une taille de réaction supérieure à celle requise.
- Ajoutez un échantillon de 8 μL, un ARN de contrôle positif ou un témoin négatif au mélange de réaction RT au sein d’un poste de PCR dans une salle de matrices. Le témoin positif de la RT est l’ARN extrait de la culture cellulaire infectée par la souche RABV CVS-11 (virus de provocation standard-11) et conservée à -80°C. Le témoin négatif contient de la ddH2O sans RNase.
- Mélangez le contenu des tubes RT par vertexation, puis centrifugez brièvement.
- Chargez les tubes de réaction dans un thermocycleur. Configurez le programme de synthèse de l’ADNc avec les conditions suivantes : 42 °C pendant 90 min, 95 °C pendant 5 min et 4 °C en attente. Réglez le volume de réaction sur 20 μL. Démarrez le cycle RT.
2. PCR de première série
- Conservez les réactifs de PCR énumérés au tableau 2 sur de la glace dans une pièce blanche jusqu’à ce qu’ils soient utilisés, puis décongelez-les et agitez-les.
- Préparez le premier mélange de PCR dans un tube de PCR de 0,2 mL avec les réactifs indiqués dans le tableau 2.
- Ajoutez un échantillon de 2 μL d’ADNc ou de plasmide dans le mélange de PCR de premier tour dans un poste de PCR dans une salle de modèles. Le contrôle positif de la PCR est de l’ADNc CVS-11 préparé comme mentionné à l’étape 1.3 pour la méthode RT ci-dessus. Le contrôle négatif de la PCR est dd H2O.
- Transférez les tubes scellés dans un thermocycleur PCR et effectuez un cycle en utilisant les paramètres énumérés dans le tableau 3.
3. PCR de second tour
- Préparez le deuxième tour du mélange PCR dans un tube PCR de 0,2 mL à l’aide des réactifs indiqués dans le tableau 4.
- Ajouter 2 μL du produit PCR de premier tour dans le mélange PCR de deuxième tour. De plus, incluez dd H2O comme contrôle négatif de la PCR de deuxième tour.
- Effectuez un cycle thermique PCR en utilisant les mêmes paramètres que ceux indiqués à l’étape 2.4.
Tableau 1 : Réactifs de transcription inverse pour la synthèse de l’ADNc.
| composant | Volume par réaction (μl) |
| dNTP (2,5 mM ) | 4 |
| Amorce aléatoire (50 μM) | 1.5 |
| Oligo(dT) 15 (50 μM) | 0,5 |
| Tampon M-MLV (5x) | 4 |
| M-MLV transcriptase inverse (200 UI/μL) | 1 |
| RNasine (40 UI/μL) | 1 |
| Volume total | 12 |
Tableau 2 : Réactifs de la première série de PCR.
| composant | Volume par réaction (μl) |
| dNTP (10 mM) | 1 |
| Ex-Taq (5 U/μL) | 0,3 |
| Tampon Taq (10x) | 5 |
| N127 (20 μM) | 1 |
| N829 (20 μM) | 1 |
| jj H2O | 39,7 |
| Volume total | 48 |
Tableau 3 : Paramètres de cyclage de la PCR de premier et de deuxième tour
| température | Heure | cycle |
| 94 °C | 2 min | 1 |
| 94 °C | 30 secondes | 35 |
| 56 °C | 30 secondes | 35 |
| 72 °C | 40 secondes | 35 |
| 72 °C | Durée : 10 minutes | 1 |
| 4 °C | ∞ | |
Tableau 4 : Réactifs de la PCR de deuxième tour.
| composant | Volume par réaction (μl) |
| dNTP (10 mM) | 1 |
| Ex-Taq (5 U/μL) | 0,3 |
| Tampon Taq (10x) | 5 |
| N371F (20 μM) | 1 |
| N371R (20 μM) | 1 |
| jj H2O | 39,7 |
| Volume total | 48 |