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Article de méthode

PCR imbriquée pour détecter une séquence génomique virale spécifique

2.1K vues

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8 juillet 2025

Dans cet article

Résumé

Source : Feng, Y., et al. Évaluation d’une réaction en chaîne universelle de la polymérase à transcription inverse imbriquée pour la détection des lyssavirus. J. Vis. Exp. (2019).

Cette vidéo décrit la réaction en chaîne par polymérase imbriquée, une technique qui consiste en deux processus d’amplification PCR séquentielle à l’aide de deux jeux d’amorces. Le premier ensemble d’amorces est destiné à recuire les séquences en amont du deuxième ensemble, ce qui entraîne une amplification sélective de séquences génétiques spécifiques. Cette PCR est plus sensible et plus spécifique qu’une PCR normale et est largement utilisée comme technique de détection pour diverses maladies.

Protocole

1. Transcription inverse de l’ARN viral

  1. Retirez les réactifs RT énumérés dans le tableau 1 du congélateur, conservez-les sur de la glace, puis décongelez-les et vortex-les avant de les utiliser.
  2. Préparez 12 μL de mélange réactionnel RT dans un tube PCR de 0,2 mL avec les réactifs énumérés dans le tableau 1. Permettre des variations de pipetage en préparant un volume du mélange maître d’au moins une taille de réaction supérieure à celle requise.
  3. Ajoutez un échantillon de 8 μL, un ARN de contrôle positif ou un témoin négatif au mélange de réaction RT au sein d’un poste de PCR dans une salle de matrices. L....

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Déclarations de divulgation

Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
jjH2Odiversdivers
dNTP (10 mM)TakaraN° 4019
dNTP (2,5 mM)TakaraN° 4030
Ex-Taq (5 U/μL)TakaraRR001
Tubes de microcentrifugationdiversdivers
M-MLV transcriptase inverse (200 UI/μL)TakaraRéférence 2641A
Oligo (dT)15TakaraRéférence 3805
Machine PCRBIO-RADT100
Tubes PCRdiversdivers
Pipetteursdiversdivers
Abécédaire aléatoireTakaraRéférence 3801
Inhibiteur de la RNase (40 UI/μL)Takara2313A
Sans RNase ddH2OTakaraRéférence 9102
Tampon Taq (10x)TakaraRéférence 9152A
Conseilsdiversdivers
Mélangeur vortexdiversdivers

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